CM和VIPS的新应用：生产基因治疗载体

工作流程概述

该工作流程是生产携带GOI（Gene of Interest）的重组病毒载体，用于感染患者的目标细胞或组织，如眼睛或CAR–T患者的T细胞。

目前，对于基因治疗早期阶段的公司来说，大多数载体生产仍然是通过瞬时转染进行的。然而临床试验需要大量的材料，目前方法显然难以满足。当前的方法除了成本高昂外，批间一致性、足够的滴度以及符合GMP要求的载体质量和安全性也都存在很多问题。因此，基因治疗公司越来越需要“稳产”的细胞株。

由于这些细胞株生产治疗/生物制剂，因此有一个隐含的要求，即它们必须具有单克隆源性（从单个细胞起始而来）以获得FDA或其他监管机构的批准。 利用Solentim的稳定细胞株开发工具，我们的首批基因治疗客户在不到3个月的时间内，已经开发并储存了稳定的高产量克隆，并具备单克隆源性。

现有的基因治疗客户主要使用两种病毒基因传递方法:慢病毒(LV)或腺相关病毒(AAV)，如下图所示:

包装细胞株将产生衣壳或空病毒颗粒，作为未来生产细胞株的“母”细胞株，通常通过瞬时转染制备少量的材料。而生产细胞株则需要是一种稳定的GOI细胞株，用于制造最终的大量临床用材料。

生产出的细胞用于感染分离的患者细胞(体内或外)如T细胞，或也有可能直接注射到患者体内进行长期的体内载体生产。

下一步：单细胞铺板

将单个细胞从一个群体中分配到96孔微孔板孔中，这个过程需要高效率即大多数孔都只包含一个细胞，并且这个过程不能伤害细胞的活性，以能在接下来的几天里长成群落。

根据病毒类型的不同，包装细胞株和生产细胞株都可能需要这种铺板过程。客户使用的细胞类型可为贴壁或悬浮，如HEK293、293T、HeLa等，对于贴壁细胞，用流式（FACS）的效果不好，因此许多客户仍然使用有限稀释法。

Solentim开发了VIPS作为这些附着细胞的单细胞铺板首选方法，可在约10分钟铺完一块板，其中超过80%的孔为单克隆孔；由于分配方法温和，这些孔中的大多数细胞都能存活下来并生长为细胞群落。

为监管部门提供单克隆源性证据和文件

将单个细胞铺入96孔板后，细胞被动沉降或离心到孔底，然后用VIPS或CM在第0天对整孔成像确保克隆性。在随后几天的生长直至最终的群落形成的过程中继续成像，整个过程可能需要10–21天，取决于不同的细胞类型。

软件为每孔都创建了一个图像库，可以从细胞群落一直追溯到第0天，并确定是否从单个细胞开始。对于单克隆孔，可以快速地将图像组合成单克隆源性报告提供给监管部门。

生产细胞株筛选

证实有单克隆源性的克隆，转入24孔深孔板，无血清培养基中适应和培养，之后对克隆进行筛选和病毒产量排序。最后，进行摇床或ambr培养，在较高的细胞密度下筛选最佳培养基和培养条件，并预测放大生产条件。通常会选择排序前三或四名的克隆进行遗传稳定性研究、评估生物反应器产量和载体质量。