从不到200个克隆中筛选出商用生产细胞株
组合应用ATUM Leap–In transposases® 转座酶技术与Solentim的VIPS™和Cell Metric®设备。
图示：ATUM的细胞株开发团队和超净台中的VIPS
科学家们一直致力于优化工作流程，更快地开发出高产细胞株，本文展示和说明了仅用几块板就能快速有效地达到这个目标。
导语
在采用随机整合方法建立的转染细胞pool中，科学家需要象淘金一样从数万计的克隆中筛选出高产株。
随机整合方法导致高产和稳定整合的概率非常低，因为产生的大多数克隆中，插入的外源基因以重排或串联重复等方式为主，从而容易导致基因的融合或缺失表达。
这些意料之外的转基因结构会带来两个不良影响，一是蛋白的亚单位表达比例不可预测，这有可能增加与产品本身有关的杂蛋白水平，二是增加了遗传不稳定性。
最近ATUM开发的Leap–Intransposases®表达技术，利用转座酶介导整合（基因转座）的原理，将结构完整的单拷贝基因，同时插入到多个转录活跃的基因组位点上。
催化重组基因整合的Leap–In转座酶，采用反式方式由mRNA翻译产生，只在催化基因转座过程中短期存在。因此，Leap–In技术非常适合具有临床应用前景/商业用途的生产级细胞株的开发。
Leap–In技术与VIPS™/Cell Metric®设备的联合应用，可以大幅度减少每个项目为了获得高产细胞株所需的备选克隆数量(实际需处理的多孔板数量)，同时还能确保高产细胞株的克隆源性（clonality）。
材料与方法
利用Horizon Discovery BIOP3 CHOK1 GS KO细胞作为宿主细胞株，生产一种模式抗体。整个工作流程的不同特性将在以下各步骤中加以描述。
分子生物学
转座酶介导的基因整合可以保持外源基因的结构完整性。ATUM由此开发出一整套载体和无专利冲突的具有知识产权的调控元件，在用单个表达载体表达多亚单位蛋白产品时，可以精确控制各个亚单位的比例(见图1)。
图1–Leap–in转座子
两个不同的亚单位蛋白，比如抗体的重链和轻链(见图2)，或者新一代蛋白药物含有的三个、四个甚至更多的转录单位，都可以按照稳定和理想的比例表达，不需要用不同质粒共转染，也没有基因重排导致比例改变的风险。
图2 –基于Leap–in基因转座原理整合的外源基因具有稳定的结构完整性，能够严格控制一个表达载体中不同亚单位的表达比例。这个特点这不仅能提高产品质量，还可减少备选克隆数量。
此外，ATUM专有的密码子优化平台还能确保最高的转录和翻译速度，实现高水平蛋白表达。
转染和稳定细胞pool的建立
基于基因转座原理的环状质粒和编码Leap–In转座酶的mRNA被共转染宿主细胞。在细胞内编码转座酶的mRNA在48小时内会被降解，因而转座酶的表达是瞬时的，且转座酶将外源基因靶向转录活跃和开放的染色质区域进行整合。
Leap–In的整合机制确保了单拷贝外源基因在特定的位点上整合。根据筛选强度的不同，在一个细胞内整合的拷贝数在2到60个之间。
转染完成后，稳定的批量生产细胞pool（bulk pools）即被建立。使用DHFR, GS或抗生素标记，该技术已成功地用于建立高产CHO稳定细胞pool。
由Leap–In技术建立的稳定细胞pool具有一个显著特性（参见图3）：克隆产量分布显著偏向于高产克隆。这种分布特点使得可以从很少数目的备选克隆就能分离出高产细胞株。
图3 – Leap–In稳定细胞pool的特征克隆产量分布。左图：按表达水平克隆产量分布分为四组，结果显示对高产克隆的强烈偏向。右表显示了稳定细胞pool的平均克隆产量分布值，数据来源于对8个不同类型(单抗、双特异、融合蛋白)产品的统计。
这种克隆分布的显著特点，使细胞pool与其衍生的单克隆细胞株的蛋白产品质量具有很高的可比性，因此完全可以利用稳定细胞pool来提前优化产品质量。
单细胞克隆步骤
在细胞系开发流程中，用VIPS可进一步降低需要表征和排序的起始筛选克隆数量，因为其在单个细胞铺板时就可以识别出单克隆。由于使用了VIPS，一个项目只需要几块96孔板(100到200个目标克隆)就可以完成单细胞克隆筛选的目标。
所用的培养基为EX–CELL CHO Cloning Medium(Millipore–SIGMA)，细胞池（VIPS的细胞喷盒，Cell Reservoir）中细胞密度在9K–12K cells/ml之间。Cell Metric则用于从单细胞到克隆生长全过程中的每日整孔成像纪录。两种仪器通过服务器同步连接，来自两个仪器的同一批次的所有图像最终将会体现在同一个完整的克隆源性报告中。
结果
由于备选克隆数量相对较少并且VIPS单细胞铺板效率非常高(见图4)，因此一旦建立了稳定的转染细胞池，即可启动单细胞克隆步骤。对蛋白产量和质量的评估，可以同时对稳转细胞pool和对克隆生长率进行排序。
图4 – VIPS单细胞铺板结果。例中铺板效率为87%。绿色孔=单细胞；红色孔= >1细胞；灰色孔= 0细胞。
HDBIOP3衍生克隆的典型克隆效率(生长率)为50%，约44单个细胞克隆/板。选出最佳的转染细胞pool后，来自该pool的单细胞克隆随即进入克隆排序阶段。
Leap–In 细胞株开发（CLD）工作流程有2个克隆排序阶段:
阶段1
在VIPS 96孔板单细胞克隆步骤中只需要少量的克隆(< 200)。目标克隆被转移到24孔深孔板中，采用7天补料培养的方式进行分级。
阶段2
选出最好的24个克隆，采用14天Ambr15或摇瓶/TPP培养进行评价分级。最后，将最好的8个克隆转入125ml摇瓶，采用14天补料培养的方式进行评价分级。
这样可以在7到10周内，从稳定的细胞pool通过单个细胞铺板筛选出高产克隆(见图5) ，具体时间长短取决于CQA排序的复杂性。
图5–Leap–In转座酶技术建立稳定细胞pool，克隆排序工作流程范例。使用Horizon Discovery的HDBIOP3宿主细胞，建立Leap–In抗体表达细胞pool。 (注意：Leap–In技术的典型克隆分布显著减少了排序克隆数量)。按ATUM标准的两阶段流程，对166个克隆进行分级排序，最终得到的克隆产量约为4g/L。
遗传稳定性不是Leap–in稳定细胞克隆的分级排序参数。到目前为止，通过评估表达水平，转基因拷贝数，生长特性，和转基因cDNA序列，显示所有的克隆都具有良好的稳定性。
讨论
传统的细胞株开发过程需要筛选数万个克隆。
由于采用了ATUMLeap–In transposases®转座酶介导的稳定基因整合技术，加之使用VIPS 和Cell Metric在开发流程的早期就能确保单克隆性，故而克隆筛选的负担大幅度降低(每个项目只需100到200个克隆)，可以并行开展大量的细胞株开发工作。
科学家们曾以为必须筛选数千计的克隆才能找到最好的高产细胞株，上述结果会让科学家彻底改变这个思路。
原有的想法包括采用全自动工作站处理数十块96孔板，并担心每板的操作速度；或考虑用细胞分选方法，“在线”地用荧光标记筛选高产细胞株，甚至考虑采用新的高通量光电子筛选系统，比如Beacon®。
其实现在只需要几块板就够了。以下我们总结了使用Leap–In转座酶、VIPS 和Cell Metric的组合重新定义的工作流程(见图6,可点击横屏放大阅览)。
图6–使用Leap–In转座酶、VIPS 和Cell Metric的组合重新定义的工作流程