Nav1.7研究的新方向：培养皿里的疼痛模型（Pain–in–a–Dish ）
Neil Andrews，1 Apr 2019
当研究者从细胞和分子水平理解疼痛时，作为实验工具，来自动物的背根神经节神经元（DRG，最近亦有来自于人类捐赠者）以往最为人熟知。但现在游戏有了新的玩法。研究者目前正转向用诱导多能干细胞(iPSCs)和分化出的感觉神经元(iPSC–SNs)，去了解疼痛的状况和神经生物学机制。最近的两篇文献利用这种“培养皿里的疼痛”模型（Pain–in–a–Dish），并结合一些传统的实验手段，对钠离子通道Nav1.7突变导致的罕见疼痛进行了研究，显示了对患者的价值。
第一项研究由耶鲁大学的Stephen Waxman领导，主要研究了一个Nav1.7功能获得性突变引起的遗传性红斑肢痛症(IEM)家庭。所有患病的家庭成员中nav1.7–s241–t的致病突变都相同，但母亲只有轻微的疼痛，儿子却有严重的疼痛。利用各个体来源的iPSC–SNs，研究人员发现这些细胞的不同电兴奋性与母子表现出的不同疼痛特征相吻合。此外，全外显子组测序还显示，母亲对疼痛的抵抗能力在很大程度上是因为KCNQ2基因（编码一种钾离子通道）的突变。
参与此研究的Ted Price（德克萨斯大学）评论说，这项研究“很好地证明了外周感觉神经元的兴奋性与疼痛表型直接相关”。“找到母子间神经细胞兴奋性的差异，然后进行全外显子组测序，将范围缩小到一个非常特殊的钾离子通道，而这个通道解释了两人间的大部分差异，这个研究提供了非常详细的信息。”“如果在我读研究生时有人说在15年内可以在疼痛领域做这样的研究，那时的我肯定不会相信。”
这项研究发表在2019年1月16日的《神经科学杂志》（Journal of Neuroscience）上。
在第二项研究中，英国牛津大学的David Bennett和他的同事们也使用了iPSC–SNs，发现Nav1.7功能缺失性突变导致了三个先天无痛症(CIP)患者缺乏功能性痛觉感受器。与Waxman团队的工作类似，该研究也显示了将iPSC–SNs与其他技术相结合的好处，包括感觉分析、显微神经造影、脑成像和基因编辑，以揭示更全面的疼痛状况。
德国亚琛大学的Angelika Lampert说:“这是一篇非常好的论文，在理解Nav1.7如何工作和帮助传输痛觉的信号上取得了进展。““研究涵盖了从患者到分子生物学的各个水平。iPSC来源的细胞中有患者的全部遗传背景，提供了几乎是在自然环境中观察Nav1.7的机会。这项研究可以帮助理解这个离子通道的作用，” Lampert说，她也在利用iPSC–SNs研究疼痛和Nav1.7。Bennett团队的研究发表于2019年3月6日的《神经元》(Neuron)杂志上，并附有Waxman和Sulayman Dib–Hajj的“Preview”。
相同的基因突变，不同的疼痛表型
多年来Waxman团队一直在研究IEM，俗称为“灼烧人综合症”。患者对轻微的热度有强烈的疼痛反应——烧灼、燃烧、滚烫的疼痛。大多数IEM患者对现有药物没有反应，但在2009年，Waxman和他的同事在一个IEM家族中发现了一种称为V400M的Nav1.7突变，该家族对钠通道阻断剂卡马西平有反应(Fischer et al.，2009)。
几年后，基于William Catterall团队发表的细菌钠离子通道的晶体结构（Payandeh et al ., 2011）, Waxman团队设计了一个人Nav1.7模型，把V400M突变作为“种子”在患者数据库中去寻找可能对卡马西平有反应的其他突变病例。这个模型预测另一种突变S241T符合这一要求，后来的体外实验予以了证实(Yang et al.，2012)。
图示：依据细菌钠离子通道的晶体结构，团队设计了一个人Nav1.7模型。S241T三维空间上与“种子”突变V400M十分接近。Yang Yang et al., Nature Communications volume3,Article number: 1186 (2012)
接下来对找到的两名IEM患者（北美的一对母子，有相同的S241T突变）进行了为期四年的研究，两个人都对卡马西平有反应(Geha et al.， 2016)。研究人员让母亲和儿子在14周内记录详细的疼痛日记，以准确掌握他们的疼痛表现，帮助形成新研究的基础。
“日记为我们提供了深入的定量数据。虽然患者都有相同的S241T突变，但日记显示儿子的疼痛很严重，而母亲受到的影响却要小得多，属于中等疼痛。” “在那时我们决定去了解，倒底是什么保护着母亲? 难道她携带了一种抵抗疼痛的基因或基因突变?”
研究小组决定用iPSC–SNs来回答这个问题，新的研究中也带上了这个家庭的父亲（没有IEM，也无S241T突变）。团队觉得尽管可能性很小，但仍值得一试。
“我们想知道，能否用iPSCs分化的感觉神经元来捕捉或再现两个家庭成员间的个体差异。我们知道这次赌大了，因为大多数疼痛研究者都会觉得，是母亲大脑中发生的一些事情让她对疼痛有了抵抗力，原因并不在外周感觉神经元中，”Waxman说。
电生理学反映了疼痛的表型
他们的赌赢了。研究小组先确认iPSC–SNs具有成熟神经元的关键功能，确认S241T突变体转录本存在于母子对中，未患病的父亲只有野生型转录本。之后开展了一系列iPSC–SNs的电生理学研究。首先，利用多电极阵列(MEA，Axion Mastro Pro)得到细胞电生理特性的全景图，发现不同受试者在不同温度下的细胞放电特性有所不同。母与子的iPSC–SNs中都发现了对温暖的异常放电反应，根据杨洋(共同第一作者，负责MEA实验)的研究，其神经元过度兴奋的pattern与其不同的疼痛表型相一致。
MEA结果图示：P300[儿子]、P301[母亲]和P303[未受影响的父亲]的iPSC–SNs动作电位（AP）放电。热图为MEA多孔板几个代表孔的结果。各活性电极的放电频率用颜色显示: 白/红，高放电频率; 蓝色/黑色，低放电频率。每个圆点表示8X8个电极阵列中的一个活动电极。顶图，儿子的iPSC–SNs在33°C、37°C和40°C下的记录。中图，母亲的iPSC–SNs在33°C、37°C和40°C时的记录。底图，对照父亲的iPSC–SNs在33°C、37°C和40°C下的记录。Mis et al. J Neurosci. 2019 Jan 16; 39(3):382–92
“我们在父亲的iPSC衍生的感觉神经元中只看到非常少的动作电位，母亲的则显示出中等程度的放电。但儿子的神经细胞却像疯了一样兴奋，”杨洋说。他最近离开了耶鲁大学，到普渡大学(Purdue University)任教。他接着说:“用这种全景观察神经放电的方法鉴定出如此强的表型后，我们还应该更深入地去揭示其分子机制。”
图示：Axion Mastro MEA技术的工作原理。
包括Malgorzata Mis（第一作者之一）的研究小组将电生理学研究扩展到细胞膜的兴奋性。全细胞膜片钳可以揭示iPSC–SN兴奋性的变化，这种变化与研究对象的不同疼痛特征相对应。在去极化刺激下，儿子的细胞激发的动作电位最高; 神经元重复放电的比例最高; 触发动作电位所需的电流阈值最低和去极化静膜电位最高。在每一项测试中，对照父亲的iPSC–SNs都表现出最少的兴奋性，而母亲的细胞尽管也过度兴奋，但位于父亲和儿子之间。
进一步的实验表明，正是静息膜电位的差异导致了细胞间兴奋性的差异。去除这些差异后，儿子和母亲的iPSCs就看起来很相似。
“在发现静膜电位的差异后，将母亲的细胞去极化4毫伏，或将儿子的细胞超极化4毫伏，我们发现就能够消除兴奋性的差异，”进行这些实验的Mis说。
钾离子通道突变
为了解母子间iPSC–SN兴奋性的差异是如何产生的，研究组对来自该家庭的样本进行了全外显子组测序。他们还使用了一种叫做 ingenuity pathway analysis (IPA)的工具，根据在背根神经节(DRG)神经元中表达的基因，去过滤全外显子组测序鉴定出的变异。
这样鉴别出母子间不同的90个突变。结合电生理学数据，研究人员最终将注意力集中在KCNQ2的一种错义突变上，这种突变母亲有，儿子没有。KCNQ2是一个编码钾离子通道Kv7.2的基因，这种离子通道负责调控痛觉DRG神经元的兴奋性。这个突变是一种功能获得性突变，它增加了一种钾离子通道电流，称为M电流。
“相比起电压门控钠通道，我们对电压门控钾通道的功能仍知之甚少，”Price告诉PRF:“我们有必要去更好地理解这个领域，已有多个研究表明电压门控钾通道对兴奋性也很关键，而在这方面我们还远远落后。“
研究人员接着假设，母亲的基因突变使她对疼痛更有抵抗力，并用动态膜片钳(结合膜片钳电生理学和计算机模拟)来验证这个想法。结果证明这个假设是正确的。
“动态膜片钳法可以定量和精确地从母体细胞中减去突变电流，然后用野生型电流替代”，Waxman说。就细胞的电兴奋性的角度而言，“这把母亲的细胞变成了看起来像儿子的细胞”。
研究小组表明，这种突变导致静息膜电位超极化和增加了电流阈值，从而降低了母体细胞的兴奋性。
但Waxman强调，KCNQ2变异虽然对母亲的疼痛抵抗力有很大的贡献，但很可能并不是唯一的可以增强抵抗力的突变。“考虑到有那么大量的疼痛患者人群，几乎可以肯定还有其他的疼痛抵抗基因，没准儿还有很多。”
这一切意味着什么?
Waxman最后还强调，结果显示了对疼痛的抵抗力并不仅仅来自大脑的机制。“我们并不是在否认更高水平调控机制的重要性：它们是真实的，而且很重要。但至少在这个患者身上，存在着疼痛抵抗的外周机制。用一种非常粗略的说法，疼痛抵抗力不仅存在于大脑中，也可能存在于外周神经系统中。”
研究还显示了iPSC–SN方法的成果。“尽管比较费力和复杂，但用基于iPSCs的培养皿里的疼痛模型来模拟个体间的疼痛差异是可能的。结合全外显子组测序，还找到了一种保护性或调节性的基因突变，” Waxman解释说。
“这些iPSC–SNs细胞显然是易兴奋的，”Price说。“它们表达了许多在原生DRG神经元中发现的电压门控通道，而我们对人DRG神经元的了解其实是有限的。如果你真想了解基因如何导致了神经疾病和感觉神经元的兴奋性在个体间的不同，这是一个有用的漂亮范例，在我看来，这就是未来。”
看看相反的病例
Bennett组也用了iPSC–SNs和许多其他技术来检测Nav1.7对CIP（先天无痛症）的贡献。Bennett说，尽管疾病已知是由Nav1.7功能缺失性突变导致的，但问题确切的出在痛觉系统的哪个部份，以及痛觉感受器的离子通道是如何影响神经兴奋性和功能的，都还没有得到很好的理解。
“我们想知道Nav1.7是在哪里改变痛觉过程的:是痛觉感受器不能对有害的刺激做出反应吗?是脊髓内的突触传递有问题吗?或者，尽管可能性较小，在痛觉过程中是否还存在更多的中枢缺陷?”，Bennett说。“然后，在一个更为机制的层面上，我们想弄清楚离子通道是如何调节痛觉感受器的兴奋性和功能的。”
没有痛觉感受器?
iPSC–SNs能在很大程度上帮助回答这些问题，但研究人员首先对参与研究的三名CIP患者进行了详细的感觉评定（sensory profiling），确认了Nav1.7中存在复合杂合突变（compound heterozygous mutations）。定量感觉检查(QST)显示，这些个体象预期的那样无法检测有害的热或机械刺激，但却具有正常的机械感觉阈值（MDT）和震动感觉阈值（VDT）。合并其他的研究表明，是小纤维神经功能受到了损害，而大纤维则没受影响。
支持小纤维异常的还有表皮内神经纤维密度测量和显微神经造影(记录支配皮肤的单个神经纤维的活动)，都显示了皮肤中的神经纤维密度非常低，并缺乏具有C类痛觉感受器特征的神经纤维。
“发现支配表皮的痛觉感受器大大减少了，这很出乎意料。表明CIP的一些表型不仅与神经兴奋性有关，还存在这样一个事实：在结构上，痛觉感受器并不在它们应在的位置。” Bennett说，这篇论文发表后，他还看到了另一个皮肤也没有痛觉神经支配的CIP患者。“有一种假设是，如果用药物阻断这个通道，你就可以复制出CIP的表型，但也许在发育过程中没有Nav1.7也影响了痛觉感受器的正常分布。它们的轴突没有到该到的位置，也就是在皮肤里的目的地，或者它们从这些目的地中撤走了。”
图示：健康对照组(D)和患者实验组(E)的小腿皮肤活检显示，CIP患者没有表皮内神经纤维，但存在真皮纤维。箭头表示神经纤维在表皮和真皮之间的交叉位置。虚线表示表皮和真皮的分界线。比例尺50μm。McDermott et al. ，Neuron. 2019 Mar 6;101(5):905–919.e8。
“这篇论文发人深省。我在想，如果Nav1.7 KO（敲除）的老鼠能活到30岁，它们会失去表皮神经吗? 我打赌是患者的无痛状态导致失去了支配表皮的神经，而不是没有神经导致了无痛。”英国伦敦大学学院（UCL）的John Wood在给PRF的一篇评论中写道。“在小鼠和人的缺失突变体中，痛觉输入都明显减少；但人缺失突变体没有功能的痛觉感受器这点，并没有得到显微神经影像的证实。这也是合理的，就像在老鼠实验中观察到的一样，人可能仍有有功能的痛觉感受器，但由于缺乏神经递质释放，这些感受器无法将信息传递到中枢神经系统。”
最后，研究人员把从CIP患者中鉴定出的新Nav1.7突变在一个异源表达系统里表达，膜片钳记录表明离子通道功能完全丧失。
观察大脑，超越疼痛
研究人员还使用了动脉自旋标记技术（arterial spin labeling），以脑血流的变化间接测量了一名CIP患者的脑活动。他们发现，对涂抹在皮肤上的辣椒素的反应，患者几个脑区的脑血流变明显减少，而健康对照组则在许多皮质区域普遍增加。
此外，当比较神经病理性疼痛量表时（NPS, 与健康受试者病理疼痛相关的脑活动模式，Wager et al., 2013），研究人员发现与CIP患者相比，健康对照组的NPS反应值明显更高。
“对照组成员全都感到强烈的疼痛，神经疼痛的指标也有很大的上升。而CIP患者感觉不到疼痛，大脑皮层的反应也有很大的减少，” Bennett说。
研究人员还想测试除了疼痛之外的其他感觉通道（sensory modalities）。“之前在询问病人症状时,全围绕在是否感觉疼痛这事上,但我们意识到，还可能有不少其他感觉通道的轻微缺陷。比如瘙痒与疼痛有很多相通之处,但在这些患者上没有被研究过,” Bennett强调说。
有趣的是，研究人员发现患者对引起瘙痒的物质（组胺和芥末油）有过敏反应（flare reaction），但却没有报告瘙痒或疼痛。发生过敏显示皮肤中的一些神经纤维可以对有害的刺激做出反应，并产生动作电位。
“患者明显产生了过敏，但显微神经造影却显示缺乏对机械刺激不敏感的C纤维(CMi或睡眠C纤维)，而这类纤维通常认为是和过敏有关的。所以，乍一看这着实让人惊讶。” Bennett 说，“实际上皮肤活检表明，有更深的真皮纤维存在，而这些神经纤维可能是导致皮肤过敏的原因。很明显这些纤维在皮肤中起了作用，但这种活动似乎没有传递到中枢神经系统。”
这又是怎么回事? “也许是因为缺乏Nav1.7的这些纤维的传导速度非常慢，正常的显微神经记录无法捕捉到它们的反应，”Lampert继续说道。“也可能是激活这些深层的真皮纤维很难。倒是有一个有趣的问题，对患者进行显微神经记录时，你能不同地激发出电诱发的过敏反应，或化学诱发的反应吗?”
培养皿中的疼痛（Pain–in–a–dish）
用iPSC–SNs研究者进一步描绘了CIP受试者的疼痛画面。先对分化出的iPSC–SNs进行鉴定，发现这些细胞表达有Nav1.7，并且表达的基因与人DRG神经元相似。之后，用基因编辑技术CRISPR将血凝素(HA)标记敲入Nav1.7基因，让研究人员能够看到细胞内离子通道的转运（trafficking）。
论文第一作者之一Lucy McDermott与牛津大学的Greg Weir说:“人Nav1.7的抗体不难得到，通过敲入HA标签，我们能很好地探测该通道在iPSC分化的疼痛感受器中的位置。”负责CRISPR实验的McDermott说 :“有趣的是，我们发现Nav1.7在轴突末端非常丰富，表明它可能在那里发挥着相当大的作用。” 这一发现与之前报道的在啮齿类动物DRG神经中的位置一致。此外Nav1.7也存在于胞体和整个轴突上，iPSC–SNs与Schwann细胞共培养显示，在有髓鞘轴突的郎飞氏结中有Nav1.7的表达。
建立Nav1.7的转运后，该小组接着比较健康对照捐助者和CIP捐助者的iPSC–SNs之间的差异。CIP的兴奋性较差，需要更多的电流来激发动作电位，而且对延长阈上去极化电流的放电数更少。
用CRISPR修正一名CIP患者iPSC–SNs的一个SCN9A等位基因(编码Nav1.7的基因)，导致产生动作电位所需的电流回复正常。这表明通道的丢失与细胞的低兴奋性有因果关系。最后，CIP患者来源iPSC–SNs与健康对照组将Nav1.7敲除的iPSC–SNs具有相似的电生理特性。
上述实验里最吸引人的是什么? 尽管存在电生理异常，“CIP受试者的痛觉感受器仍然能够激发动作电位，这非常有趣，” Weir说。“这与这些患者对疼痛完全不敏感的事实形成了一些对比。”
Lampert说:“iPSC–SN实验表明Nav1.7是一个阈通道（在CIP中阈值升高了），你真的需要设置它。”与这一观点相一致，她的团队最近用IEM患者的iPSC–SNs做的电生理研究表明，IEF细胞中的动作电位阈值降低了(Meents et al.，2019)。
利用人iPSC–SNs进行药理学研究
同样值得注意的是，之前Wood团队的一项研究显示(Minett et al.， 2015)，在iPSC–SN研究中Nav1.7的缺失会引起内源性阿片肽上调，但在这里似乎并没有促进Nav1.7 KO iPSC–SNs的电生理表型。这是因为研究人员在使用阿片类拮抗剂naloxone处理这些细胞时，没有看到表型的变化，也没有看到敲除Nav1.7的细胞里内源性阿片类前脑啡肽的上调。
在最后一组实验中，研究小组展示了iPSC–SN方法在测试Nav1.7抑制剂的特异性方面的价值，这也是疼痛领域的药物公司正在开发的。
执行这项工作的Weir说，“大家想要的是一种非常特异性的抑制剂，它只抑制Nav1.7，而不影响其他的电压门控钠通道。” “故而我们认为把痛觉感受器敲除是一个测试临床药物对Nav1.7特异性的很好的模型，由于缺乏Nav1.7，因此药物如果对神经元有任何影响，那一定是作用于其他的蛋白了”。
他发现测试的两种抑制剂中，一种似乎对通道有特异性，而另一种则没有。后者随着剂量的增加不仅降低了健康对照组iPSC–SNs的兴奋性，也降低了Nav1.7敲除的痛觉感受器的兴奋性，显示也对其他的离子通道起了作用。Weir说:“这给了我们一个警告，这个化合物不能剂量过大，否则它就会不特异了。”
作为可能的临床前筛选工具来评估抑制剂的特异性外，iPSC–SN还具有临床转化和个性化治疗的前景。例如，Lampert团队最近研究了一个小纤维神经病患者过度兴奋的iPSC–SNs (Nameret al.， 2019)。拉科沙胺（Lacosamide），一种已批准的治疗钠离子通道相关的癫痫药物，在体外实验里降低了兴奋性；并且如iPSC–SNs电生理学预测的一样，患者用药后也明显减轻了疼痛。这样，一个疼痛已经持续了10年以上的患者，得益于iPSC–SNs的新治疗方法改善了疼痛状况。
新与旧，旧与新
iPSC–SNs作为一种深入了解疼痛机制和推进药物开发的方法前景光明，但也有局限性，所有的研究人员也都承认这一点。
“我们不能从诱导多能干细胞中获得感觉神经元的全部亚型，目前得到的类型相对均一。” Bennett说。“尽管有痛觉感受器的电生理特性，也在实验室中培育了数周，但与成人的神经元相比，仍然是相对不成熟的发育途径。而且，我们还没有重建出一个完整的伤害性神经回路。”
对疼痛研究人员来说，将iPSC–SNs等全新的技术方法与旧的但可靠的技术方法相结合，也许更能发挥其价值。
Bennett说，我们的研究“显示了多学科联合的优势，以非常详细的方式对患者进行了研究，同时也研究了人源细胞。这样确实好处多多。”