提要:
HSCI(哈佛大学干细胞研究所)的研究人员将源自不同基因突变类型的ALS患者的诱导多能干细胞分化为脊髓运动神经元,建立和验证了ALS体外疾病模型。利用此模型,研究人员发现大多数家族性ALS基因突变都导致了神经元过度兴奋和容易死亡。研究发现,一种FDA已经批准的抗癫痫药可以提高患者来源的运动神经元的生存率和降低放电活性。由于此项硏究,该药物迅速进入了ALS的临床实验。这个工作的两篇相关的论文分别发表在2014年4月的 Cell Stem Cell和Cell Report杂志。
除了基因突变,表观遗传变异也可能与ALS相关。Northwest大学的科研人员发现,缺乏一种DNA甲基化酶DNMT3A,会抑制和激发一些转录因子的表达,导致改变了运动神经元的分化命运。而且,即使分化成运动神经元,这些细胞也存在形态和电生理功能上的异常。这个工作的论文发表在2018年4月的Cell Stem Cell杂志。
ALS
肌萎缩侧索硬化症( Amyotrophiclateral sclerosis,ALS),俗称“渐冻症”,是一种运动神经退行性病变的致命疾病。运动神经元位于大脑,脑干和脊髓中,负责联系中枢神经系统和全身的随意肌。
到目前,10%的病例被认为是“家族性ALS”,已经发现了涉及二十几个基因位点的一百多种突变类型。全基因组关联硏究发现,家族性ALS患者和一些散发性ALS患者的基因变异有许多相似之处。这些基因变异可能使人们更容易遭受ALS影响。
ALS体外疾病模型建立和验证
两名携带SOD1 A4V/+突变的患者(39b,RB9d)和两个健康对照(11a和18a)的皮肤成纤维细胞经重编程成为诱导多能干细胞,随后在同一块MEA多孔板的不同孔中,相同条件下培养分化为脊髓运动神经元。分化培养4周后,利用 Axion Maestro同时记录和比较四组细胞放电,显示突变细胞自发放电活性明显高于对照(图一,图二),这证实了之前临床上发现的ALS神经元“过度兴奋”的特征,也验证了体外疾病模型的可靠性(1)。此外,发现突变细胞凋亡率高,胞体变小;而对动作电位电流的分析,则发现钾离子通道受到抑制,Retigabine(一种钾离子通道开放剂)可降低放电,提高存活率。
图一:ALS组“过度兴奋”。一个孔中64个电极中4个电极记录的原始放电踪迹示意。
图二:与对照组相比,ALS(SOD1 A4V/+)神经元显示出过度兴奋:对SOD1A(红色)与对照组(黑色)神经元的放电进行分析,左图是MEA记录的每分钟总的动作电位;中图是单个神经元放电频率直方图,单个神经元对应的动作电位是通过波峰的形态和时间获得;右图显示的是数百个“单个神经元的平均放电率”的平均值。
邪恶循环?
为了排除不同个体背景的可能干扰,研究人员将一个SOD1 A4V/+突变的iPSC(39b)用锌指核酸酶靶向修正为同基因背景的“正常″对照,然后培养分化为运动神经元。突变的修正提高了细胞存活率和胞体大小,此外分析转录组,发现大部分与蛋白翻译有关的基因表达在突变组中都降低了,而这种翻译抑制是内质网应激( ER Stress)和未折叠蛋白应答(UPR)的标志。这与细胞的“过度兴奋”存在相关性吗?利用 Maestro研究人员以一系列实验揭示了它们之间的关联(图三)。
研究人员由此提出了“邪恶循环”假说(图四):错误折叠的SOD1蛋白引发ER Stress,上调了UPR,导致了运动神经元“过度兴奋”;过度兴奋又促进了 ER stress,如此循环,最终导致细胞的退行性病变和容易死亡。(2)
图三:G.钠离子通道阻滞剂TTX能有效阻断细胞动作电位产生,也明显减少了sXBP1(一种UPR的标志转录因子);H.促进细胞放电的激动剂 kainate和 linopirdine可提高细胞电活性,也提高了sXBP1的表达; I.加入ER Stress的抑制物salubrinal,细胞的放电数降低;J加入可强烈诱导产生UPR的DTT,细胞的放电数则会升高。
The Theory of Everything?
SOD1A4V/+约占家族性ALS病例中的20%,这类突变导致了运动神经元“过度兴奋”的特征,那么其他位点的基因突变呢?由于缺乏相应的动物模型,之前的研究对此并不了解。这次,研究人员把工作也扩展到另外两个重要的突变C9ORF72(约占家族性ALS病例的40–50%)和FUS。
相同于之前的方法,这次研究人员将四个SOD1,两个C9ORF7,两个FUS突变的患者来源的iPSC细胞系,以及六个正常对照,在同一块MEA多孔板中同条件分化培养,一段时间后用Maestro同时定量记录和比较放电活性,发现上述所有的ALS细胞系和正常对照相比较,都具有“过度兴奋”的特征(图五)。(3)
利用 Axion Maestro筛选潜在药物
硏究人员也发现两种钾离子通道开放剂(Flupirtine和 Retigabine)都能够降低上述三种突变细胞的放电活性。其中FDA已经批准的抗癫痫药 Retigabine,不仅可以提高体外分化的运动神经元存活率,还可以在更低的浓度下降低细胞的电活性(图六),正是由于这项工作, Retigabine随后迅速进入了ALS治疗的临床试验。
“针对像ALS这样的严重疾病,这将是药物研发方式完全改变的开始,”Clifford J. Woof说(两篇文章主要作者之一),“在传统的临床试验中,你给病人提供安慰剂或活性成分来观察效果,然后就结束了。而在这里,我们可以使用相同的干细胞系,不受限制地在培养皿里进行临床前试验。”(4)
DNA甲基化与ALS
上文中 Cell Stem Cell的第一作者,当年的博士后Evangelos Kiskinis后来去了西北大学,是2018年这篇Cell Stem cell的通讯作者,在这篇论文中他的团队关注DNA甲基化和ALS之间的联系。
在哺乳动物基因组上,胞嘧啶(C)在DNA甲基化酶的作用下会在第5位碳上加上一个甲基(–CH3),这多发生在基因组上CpG二连体的C上(图七A)。DNA甲基转移酶主要有四种:
DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。在DNA复制完成后,DNMT1催化甲基转移至新合成的DNA链上,这一现象称为维持甲基化; DNMT3A和DNMT3B则负责在核酸链上新的位点“从头加甲基”,称为形成甲基化。
体细胞DNA甲基化图谱在胚胎发育的早期建立,之后在基因组上绝大多数位点都保持稳定。然而,在一些基因表达的调控区域,在分化的过程中DNA甲基化呈现高度的可塑性。研究人员认为,在中枢神经系统中活跃表达的DNMT3A和DNMT3B,通过甲基化抑制或激活了一些转录因子表达,进而调控细胞的分化命运(图七B)。
研究人员将一个人源胚胎干细胞系,分别敲除DNMT3A(3A–KO),DNMT3B(3B–KO),
DNMT3A+3B(3A/3B–KO),连同它们的亲本细胞系对照,一起在体外分化为脊髓运动神经元。采用一系列最新技术如单细胞RNA测序, Crispr Cas9甲基化编辑系统,研究人员发现,缺乏DNMT3A使一些转录因子抑制或激活,导致分化命运转向其他类型细胞如胶质细胞,因此分化产生的运动神经元变少,并且这些细胞相比于正常细胞,神经突的数目和分支明显减少,这预示着细胞间的突触连接和网络活动也会明显减少(图八)。
图八:缺乏DNMT3A的体外分化运动神经元形态异常。
利用 Axion maestro,研究人员随后对此进行功能上的验证。将同样数量3A–KO和对照的胚胎干细胞,在MEA多孔板中同样条件下培养分化为运动神经元,在第14到40天中同时检测分化过程中两组细胞的放电情况,发现3A–KO组显现出明显的“过度兴奋”(图九)。随后对动作电位电流的研究发现,这次是钠离子通道存在异常。(5)
研究人员将一个人源胚胎干细胞系,分别敲除DNMT3A(3A–KO),DNMT3B(3B–KO),
“如果观察ALS患者的DNA甲基化图谱,你会发现到处都有异常”,Kiskinis说,“这是疾病的驱动原因,或仅仅是个副产物?我们提供了一个方法去探究这个有趣的问题。”
(6)
Maestro MEA的用途和优势
◆可高通量地在微量体积内,定量检测和比较神经细胞的活性和连接性,多种形式 MEA多孔板可选。
◆非破坏性的胞外记录,能够从同一培养物中长期收集数据。
◆可在培养细胞中多个位置记录数据,用以研究神经网络的连接性和成熟性。