利用AXION 研究修复脆性X染色体综合症神经元

MIT的 Rudolf Jaenisch组一直在开发和应用一种DNA甲基化编辑工具箱，将去甲基化酶Tet1或甲基化酶Dnmt3a蛋白的催化域与失活的Cas9 (dCas9)融合，以实现靶向的DNA甲基化编辑（X. Shawn Liu et al., 2016,Cell）。

在2018年新的一篇Cell中，该组利用上述甲基化基因编辑工具去研究一种由于超甲基化造成基因沉默导致的神经发育疾病：脆性X染色体综合征（Fragile X syndrome，FXS），在患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）和其分化的神经细胞中去除CGG重复（超过450个）的甲基化，使得FMR1基因的表达恢复到正常基因的水平，同时神经细胞的过度兴奋的表型也回复到正常水平。

示意图：用dCas9–Tet1和CGG sgRNA靶向FMR1的CGG重复序列，消除甲基化，激活FMR1表达。

脆性X染色体综合症及其病因

脆性X染色体综合征（Fragile X Syndrome，FXS）是男性智力障碍的最常见病因，在男性新生儿中的发病率约为1/3600。该综合征还导致一些自闭症的表征，如社交和沟通障碍，注意力分散和多动症。目前尚无治愈这种疾病的方法（图一）。

图一：脆性X染色体综合症。

这些疾病缺陷是由于大脑在发育过程中缺乏FMR1基因编码的FMRP(脆性X染色体智力障碍蛋白)导致的。FMRP是一种RNA结合蛋白，它在突触发育的蛋白合成过程中起到分子刹车的作用。有证据表明在病人来源的神经细胞中，由于缺乏FMRP导致了一些神经递质受体和离子通道过度表达和插入细胞膜，使得突触过度兴奋进而影响了一系列中枢神经系统中神经环路的正常功能。

FMR1基因5’端非编码区（UTR）存在一系列三核苷酸（CGG）重复，这些重复的长度决定了个体是否会发展出脆性X染色体综合征。众多证据表明，CGG重复的扩增突变（大于200个），同时伴随着DNA超甲基化，导致了FMR1基因的启动子部位形成了异染色质结构，从而在FXS中“沉默”了FMR1基因的表达，但这一过程的分子机制尚未被充分理解。

利用Axion Maestro研究修复FXS神经元

Whitehead研究所的研究人员建立了一个CRISPR/dCas9–Tet1系统，在患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）和其分化的神经细胞中去除CGG重复（超过450个）的甲基化，使得FMR1基因的表达恢复到正常基因的水平，同时神经细胞的过度兴奋也回复到正常水平。这项研究发表在2018年2月22日的Cell杂志（图二，图三）。

图二：论文内容示意。

图三：难道忘了我们是在研究人类的疾病吗？

FXS的小鼠模型由于种属特异性存在很大局限，比如利用CRISPR/Cas9去除甲基化不能回复小鼠的神经细胞活性，在完全缺陷CGG的小鼠模型中也只能有限恢复神经细胞功能。

之后“修复”的神经元被移植到小鼠大脑中，FMR1基因在神经元中保持活跃至少3个月，意味着纠正的甲基化在动物身上也许是可持续的。另外研究人员还证明了其CRISPR/Cas9系统没有明显的脱靶效应，提示了未来临床应用的前景。

其中利用Axion MEA设备，在MEA多孔板中培养经去甲基化编辑的病人来源iPSC及其他对照干细胞，分化至成熟，从第36天起检测放电活动直至第66天。实验证明了重新激活的FMR1基因修复了病人来源iPSC衍生的神经元，逆转了与该综合征相关的异常电活动（图四）。此外，利用Axion MEA设备研究人员还进一步对后有丝分裂（post–mitotic）的患者来源神经细胞进行去甲基化编辑，并和其他对照干细胞进行比较，发现针对已分化的神经细胞，去甲基化编辑也可以使放电活动恢复到与正常相当的水平（图五）。