多种因素都可能会影响CHO细胞静置培养
1.首先细胞培养基和细胞株是关键。
2.血清的问题：我一直以为在筛选的时候，最好不要加血清进行培养。但跟某评审老师聊过后，发现FDA认为血清可以加，但是得确认来源（比如禁止来自疯牛病地区的血清）。但是否会因为加了血清之后，需要做额外的验证，有待核实。
3. 细胞培养板的问题：如下截图，来自于澳大利亚CSL公司Arna Andrew的ppt，可以看到不同品牌和型号的96孔板会体现出完全不同的细胞存活、生长以及迁移的情况。这一点上，可能国内只有少数公司做过这方面的测试。当然，这个材料只是为了说明在不同的培养板中，细胞状态可能会不一样，具体选择何种细胞板，跟细胞株是直接相关的。
4. 培养体积：384孔板的克隆形成率会高于96孔板，可见孔内的培养液体积也会影响细胞的生长与增殖。可以考虑比常规384孔板更小体积的半孔板，然后中途补液。只是，铺板的实验人员会比较辛苦，384孔板太难加样了。。。
由于工作关系，常接触到一线的细胞株开发实验人员，有机会了解到各种各样的情况，有常见的，也有稀奇古怪的。养细胞是个累人的活，所以一直想整理一下，或许是某些实验人员正遇到或者将来会遇到的问题，希望能多提供一些思路。
1.细胞铺板后不能正常增殖：常见。
在细胞状态没问题的情况下，应该优先考虑培养基配方（比如适量添加克隆培养基或条件培养基）。遇到比较多的是，在静置培养的时候，直接使用摇瓶的基础培养基来做细胞板培养。静置培养通常是在进行细胞克隆挑选时进行，通常单个孔内只会有一个细胞或少数几个细胞，这与摇瓶按百分比来接种很不一样，细胞因子的水平差距巨大。因此，在静置的细胞板培养时，建议有条件做个预实验，找到合适的克隆培养基品牌和添加比例，确定好了以后，再进行正式的克隆项目。
2.细胞在板内大范围迁移：较常见。
理论上讲，CHO细胞本质是成纤维细胞，有贴壁的属性。只是大家都在悬浮培养它，却忽略了它本来就是种贴壁细胞，只是驯化成了可悬浮培养。通常，CHO细胞在板内是不会大范围迁移的（小范围是会的），出现大范围迁移的原因可能比较复杂，可能包括：1）培养基，如上面所述，添加克隆培养基可能会改善；2)培养箱的原因。这一点很多容易被忽视，比如培养箱紧挨着震动源（普遍的比如风机或生物安全柜），细胞处于长期的高频率微震动环境，会不断迁移；还有比如细胞培养箱没有水平放置，你会在7–9天开始看到细胞成规律性往一个方向跑，这种情况要去核实一下培养箱内的不锈钢平台架是否水平；3）取放过程中不注意，大幅晃动，尤其是上下颠动了培养液，这种会导致细胞被搅动起来再重新沉底，也会造成迁移；4）在培养箱内放置摇床，有实验室由于摇床不够用或者培养条件不一样，为省事或者没办法，将摇瓶和摇床放到培养箱里面进行培养，也会导致在箱体内的板内细胞大范围迁移。
3.摇床与培养箱错用：少见。
摇床主要用于摇瓶（带密封透气盖），而培养箱是专门用于培养板或培养皿；摇床基本上没有湿度控制，而培养箱是有专门的加湿盘来确保箱体内的饱和湿度；另外，由于摇床用于带盖的摇瓶，需大量的通气来确保摇瓶内的气体交换，培养板放置于摇床内，会导致剧烈蒸发。摇床和培养箱用途和设计都大不一样，不可混用、错用。
4.排枪铺板的方式：常见。
经常发现在铺板后，大多数细胞都是贴靠在孔内壁边缘，导致不好观察克隆生长。有一些经验显示，这通常都是由于实验人员为省力，将tips头依靠在孔上进行加液，液体注入进孔内后，形成涡旋，导致细胞被甩向孔壁。采用悬空、垂直加液会大幅降低这种情况出现的概率。当然，铺板的人会比较辛苦，尤其是一铺就是几十块板的时候。
5.96孔板和384孔板有差异：常见。
从目前国内客户情况看，绝大多数客户都是采用96孔板来进行克隆筛选。通常来说，两者并无太大差别，但对一些情况，两者在实际使用中还是有些不同的。384孔板由于体系小（通常不超过80μl培养基），更有利于单克隆细胞生长起来，但铺板更辛苦。如果有遇到克隆难生长的情况，可以考虑384孔板，可以在长到不超过10天的时候，进行转板，扩至96孔板。
6. 铺板浓度不准：常见。
现在大家都知道铺板浓度最好是<0.5个cell/well。但我们发现，在实际铺板操作中，常出现实际浓度明显高于或者低于该浓度。所以提醒实验人员：1.一定争取找个计数准确的细胞计数仪或计数方法；2.铺板的时候注意过一会就吹打一下Tank里面的细胞液，让沉下去的细胞再悬浮起来；3. 出于谨慎考虑，可以采用更低的铺板浓度如0.3个cell/well，来降低实际铺板浓度高于0.5个cell/well的可能性。
7.错用U或V底细胞板：少见。
绝大多数客户都是采用平底细胞板。但也遇到过使用锥底或者U底板的情况，诚恳建议客户尽量不要采用这些板型来进行CHO的细胞系开发，如果只是应用研究或者发发paper应该还好。这种情况通常出现在克隆比较难长成的实验室，为了提高克隆形成率，U或V底板效果会好一些。但实际情况是，往往这种长起来的克隆都是混合克隆。对于单个细胞，平底板与U或V底板的形成率，并无明显差别。因此，从细胞单克隆性来考虑，尽量不要使用这类板型。
8.假冒伪劣细胞板：常见。
目前应用细胞系开发的细胞板品牌，绝大多数为进口品牌。某些不良商家甚至厂商人员为了利润，掺入甚至全部是假、仿冒、残次的细胞板。这类细胞板在实际使用过程中，经常很难被发现，有个客户甚至用了几年都没觉得有什么问题。但我们在做DEMO过程中，经常遇到这种问题，在设备拍出的高精度照片底下，可以清楚地看到这类细胞板与原厂的板子差别非常大。
提问1：细胞孔内迁移
您好，请问这个问题应该如何避免呢？我现在也遇见这个问题了。养的是CHO细胞，之前用同样的96孔板子和培养基都没出现这个问题，但是这一次有限稀释的细胞，经细胞成像仪扫描发现，细胞移动的太快了，前一天还在最低端，第二天就跑到中间或者上面去了。
pk1206(彭锟老师）：
就您碰到的细胞经常大范围移动的情况：如果排除实验环境和设备的因素，我建议尝试用商品化的克隆培养基，一些大品牌如Sigma，Thermo应该都有，有的是写做Cloning Medium或者Conditioning Medium。
如之前提到，个人经验，细胞的大范围移动很多都跟培养基直接相关。关于静置培养或克隆培养使用商品化的克隆培养基，主要有两种观点，各有道理：
1.认为：反正进入摇瓶或者发酵罐培养后，培养基配方肯定会进行优化和调整，所以在静置或克隆培养时，使用何种培养基对后续的优化并不会产生太大影响，因此，直接使用商品化培养基来进行克隆培养。
2.认为：由于进入摇瓶或者发酵罐中后，所使用的培养基的营养成分会相对贫乏一些，如果在克隆培养条件下使用营养成分丰富的培养基，有导致转入摇瓶或发酵罐后生长出现问题的可能，应尽量降低商品化培养基使用的浓度或者比例。
具体情况，需要实验者根据实际情况来进行考量。比较好的方式：预实验，摸摸实验条件。采用空载CHO细胞，找不同品牌的克隆培养基、安排不同克隆培养基与CD CHO或Forti CHO浓度比率，来找到比较适合的克隆培养配方。在商品化培养基基础上，再摸条件、优化会简单很多。
克隆筛选的静置培养与振荡或者发酵罐搅拌培养相比，除了通气、搅拌等条件不一样以外，很重要的一点是接种比例。克隆筛选的静置培养要求孔内的细胞有且只有1个，导致细胞难以存活（可能是细胞因子丰度问题），为了后期克隆的筛选效率，优化出一个具有良好的单细胞存活率的克隆培养基是非常有必要的。
提问2：克隆pool的培养基以及培养基成分
克隆培养基的实验条件摸索应该采用空载CHO细胞， 是否可以使用stable pool？不同的商品化克隆培养基应该和CD CHO 或Fotri CHO 培养基按照不同比例配比作为克隆培养基吗？对2认为的观点，培养基营养成分相对贫乏导致生长出现问题的可能性，这个一般要如何确认呢？
pk1206(彭锟老师）：
当然可以采用pool来做，空载CHO优化得到的培养基可以作为未来项目中的核心成分，实际操作中，不同项目细胞的培养条件可能会有一些差异，但差异一般不会太大（不排除一些特例）。通常情况下，大家都是先得到空载CHO，然后再开始项目，所以从流程上来说，可以先用空载先优化，再随着项目进展，逐步推进优化。直接用pool做也没任何问题。
CD CHO或者Forti CHO是实验室做CHO细胞最常规的培养基了，转染用、摇瓶用，当然也可以用于克隆培养。但普遍情况下，还是专门针对克隆培养/静置培养做一些优化比较好。比如Thermo的CHO–S在CD–CHO的静置培养下，还可以（有些实验室做的这个体系也不一定好），其他的就未必了。
条件培养基的问题：条件培养基通常指经细胞培养后的培养基上清，经离心过滤除菌后作为培养基添加剂使用，目的在于提高培养基中的细胞因子丰度，利于细胞存活生长。但制备条件培养基需要注意：1. 条件培养基的制备最好与基础培养基来源一致，即如果用Thermo的CD CHO做克隆培养，那么条件培养基也应该用同一种培养基制备；2. 条件培养基制备的时候，细胞培养时间不宜过长；3. 条件培养基添加比例不宜过高。条件培养基是经过细胞培养和消耗过的上清，尽管增加了细胞因子，但营养成分也大幅降低，过高的浓度或者培养时间过长，都会导致后期克隆板中的细胞因为营养成分不足导致死亡，或会导致克隆团形成到一定阶段后，不再继续增殖长大。
Solentim近期开发了InstiGRO系列培养基添加剂，可以大幅提高细胞存活比率，从而改善克隆过程中细胞存活导致效率低下的问题。有兴趣的可以查看之前公众号文章介绍：
提问3：单克隆影像证据中的细胞增殖
万一拍到的细胞是1变3，甚至1变4能作为证据吗？要知道有时候细胞增殖不是那么规律啊！
pk1206(彭锟老师）
首先强调一点：最严谨的当然是1–2–4的细胞影像规律，其他的类型不能说不可以（具体要看评审的观点），但确实可能会有一些被挑战的风险。
一般来说，我们假设CHO是24h倍增，但考虑到几个情况：1. 实际CHO的倍增可能超过或者低于24h，尤其是CHO–S，倍增时间可能低于20h；2. 接种的细胞可能本身就处于即将分裂的状态，进入孔板后，可能很快就分裂了；3. 细胞状态不好，恢复时间较长，可能前面24h都不进行分裂。
如上情况，都可能出现。通常在实验室实际操作过程中，出于严谨考量，这类细胞/单克隆孔归入备选里面去较好。如确实要选择这类孔，需注意进行相关的数据收集。
就我们目前碰到的情况，如果宿主系统稳定的话，其实更准确地控制扫描间隔时间，是可以避开1变3或者1变4的这种情况。我们通常认为24h拍摄，都是假设了宿主细胞CHO是24h分裂，如果确认了您实验室的宿主系统并不是这样的倍增，完全可以考虑按实际倍增情况去安排扫描间隔时间。
我们在实际操作过程中还发现了一种更为普遍的情况：Day0即看到两个挨很近的细胞。对CHO–S这种比例比CHO–K1更高。经我们VIPS铺板（如下简介）操作发现，导致这种情况主要是因为沉底条件，在沉底过程中，如果时间比较长（如3小时），会有部分单克隆细胞进入分裂状态，直接变成了2个细胞，但其实其入孔的时候是单个的。在3h沉底条件下，某些极端的CHO–S细胞，这个比率能达到20%以上。在采用LD的方式时，这种细胞孔都不能作为候选。
现在有一种比较先进的铺板系统，Solentim的VIPS，这个仪器可以在细胞进入板的瞬间就完成拍照。VIPS通过纳升（nl）级别的细胞液滴进行铺板，液滴进入微孔板后，立刻对液滴进行拍照，从而在铺板时，即可知道您的项目所铺设的板子里面有多少单克隆孔（通过评估细胞存活的情况，也完全可以预估出能有多少单克隆团）。对于细胞株克隆筛选而言，VIPS会有几个优点：
1. 如园友所言，当中意的候选细胞孔出现1变3或者4的情况时，如果能拿到铺板时细胞入孔的液滴影像来确认其是单个细胞，那么就不会有任何争议了。
2. 可以大幅降低克隆所需要的铺板数量。常规的有限稀释，由于概率分布，一块板会出现60个以上的孔无细胞，VIPS会充分利用这些无细胞孔，大幅提升单克隆细胞孔的比率。通常可以达到80%以上。这样就可以大幅降低所需要的铺板数量。假设细胞存活不变：传统有限稀释40块板，能获得400个单克隆孔（每板单克隆孔20个，长出克隆团的有一半，10个）；采用VIPs可能只需要10块板（每板80个单克隆孔，存活一半即40个）。
这一点很重要，以前采用流式方式来铺板，主要的目的也是想解决铺板数量的问题，但流式对细胞伤害很大。此外，如果想采用单克隆影像拍照的方式，如果铺板数量太高，扫描所消耗的时间就会多到难以承受。
3. 不同于其他高效铺板工具，VIPS提供的是细胞入孔以后的影像（而非流路影像），因此可以提供细胞单克隆影像更为强有力的证据信息。如果其与Cell Metric结合起来使用，细胞株的单克隆性概率会大幅提升。目前，我们和我们的客户也在与FDA沟通和做一些验证：是否可以在铺板时候确认了单克隆后，后续的Cell Metric扫描次数、间隔就可以降低，甚至可以不用Cell Metric单克隆扫描？
4. 国内VIPS已经有十几台装机并投入项目使用了。目前了解下来看，细胞存活与有限稀释无明显差别，完全不用担心会额外造成细胞损伤的问题。