FIDA技术在靶向蛋白降解(TPD)应用中的优势-

概述

PROTACs、BiDACs等的生产开发十分繁琐和耗时,经常涉及到一系列不同的技术,开发过程中的许多决策都需要基于相关数据和一些假设。Fida 1能够检测流体力学半径的微小变化,提供了一种新的方法来获得许多与目标蛋白降解相关的关键参数,由于是绝对值检测,因此数据准确可靠,包括:

1.    快速和定量地测定三元复合物的完全形成。

2.    不同条件下,准确测定不同亚基之间的相互作用,包括正或负的协同作用。

3.    测定靶蛋白(POI)在三元复合物中结合的量。

4.    体外泛素化检测时,无需再用繁琐耗时的SDS-page和Western Blot等方法。

实际应用案例表明,通过观察整体结构以及不同亚基的大小的变化(size change),可以准确地确定TPD开发中的关键参数,包括三元复合物的形成、结合亲和力,以及结合在三元复合物中的POI比例。

由于Fida 1是直接在溶液中去检测蛋白或蛋白复合物的大小和大小的变化(配体与蛋白特定的成分相结合形成复合物,从而导致大小的变化),因此在TPD研究中你能够得到其他传统分子互作方法难以获得的重要信息。

在做完了上述分析后,你还能额外地能确认出蛋白的完整性或其他成分的完整性,因为Fida 1可以检测出轻微的构象变化。

C4 Therapeutics, Inc.正在开发一类新的小分子药物,通过使用细胞内在固有的机制降解和选择性地破坏致病蛋白。Fidabio已经与C4 Therapeutics合作,帮助他们获得BiDAC™结构的三元复合物和亚基的完整特征,包括所有结合亚基的KDs。

检测三元配合物的形成和评估POI在三元复合物中结合的比例

(A)  POI 10nM, E3 40nM, TPD construct 浓度梯度0-10µM分别检测; (B) 第二种TPD construct,实验条件同前; (C)第二种TPD construct,实验条件同前。

图中显示,POI和E3的浓度保持不变,用不同浓度梯度的TPD construct滴定检测分子复合物的大小,产生所预测的钟形曲线。与其他检测方法相比,Fida 1测量出的是一个大小的绝对值,其大小的增加与三元复合物的数量成正比,使用Fida1你还可以评估有多少比例的POI被结合在三元复合物中。

测定结合亲和力和协同性等

(A) FIDA实际数据与拟合模型的比较(A): POI1+TDPconstruct 蓝点,拟合模型 橙色点。协同性(alpha):14.6; KD [POITPD] 34nM; KD(TPDE) 44 nM; 复合物大小6nm。(B)POI在三元配合物中结合的百分比。

越来越多的证据表明,PROTACs分子与它们的目标蛋白可以被模拟成三元复合物结合的平衡态,特定配体(PROTAC分子)诱导的分子识别可以表现出显著的协同作用整体性。

尽管如此,许多现有的药物设计和优化方案仍然专注于二元靶点的接合(只能一个蛋白一个蛋白的分析和分子的作用模式,不能够三元整体分析,有时候解释的结果可能以偏概全),原因是三元复合物的结构数据有限。近年来PROTAC分子介导的蛋白质复合物的晶体结构解析成功,更加强调这两个靶蛋白和这个PROTAC小分子三者复合物整体的重要性。       

评估泛素化

FIDA技术可以快速、简单地评估靶蛋白POI的泛素化反应。与目前使用的如SDS-PAGE和western blot的试剂盒相比,FIDA提供了一种可在15- 30min内实时监测泛素化反应的方法。

A)泛素化反应的阴性对照,除ATP外,其他成分均添加。B)添加所有成分及20uM游离泛素(Ub)进行泛素化反应。C)添加所有成分及50uM游离泛素(Ub)进行泛素化反应。

 当P53被招募到泛素化时,fl.Ub的大小增加。已测单独的fl.Ub大小为1.81nm。可以看出,在没有添加ATP的阴性对照中,fl.Ub的大小没有增加,这意味着只有当P53发生泛素化时,fl.Ub的大小才会增加。


FIDA(流动诱导分散分析)技术原理

图示:Taylor Dispersion Analysis原理示意。

泰勒分散分析 (TDA)是一种微毛细管流技术,可基于溶液对小分子、多肽和蛋白质及混有这些物质的样品进行测定。该分析将纳升级的样本脉冲注入匹配缓冲液的一个层流,样品脉冲流经微毛细管时会因分散(轴向)和扩散(径向)而变宽,沿微毛细管在固定窗口进行的荧光检测用于分析样品脉冲横截面(从 t1 至tn)处的荧光强度,然后通过测量时间浓度曲线(或泰勒图)完成分析。泰勒图中,峰的宽度与样品中溶质的分子分散系数 (D) 相关,从而可以确定流体力学半径 (Rh)。

图示:FIDA(Flow Induced Dispersion Analysis,流动诱导分散分析)原理示意。

FIDA是一种基于毛细管的新技术,利用泰勒分散原理,在压力驱动的流体中精确测定分析物的Rh(流体力学半径)的绝对值,溶液中自然条件下生物分子间的结合亲和力(KD),以及形成的复合物的Rh大小等。检测范围:0.5-1000nm;灵敏度:5%的Rh变化。