文献解读 | ATUM转座子平台加速CHO细胞株开发流程
近年来，尤其在新冠肆虐的时候，将研发的药物尽快上市并给予患者治疗，已成为当前细胞株开发的主要关注点之一。在此情况下，越来越多的企业将传统的随机整合（同源重组）转向更稳定和高产的转座子平台技术，希望进一步加速细胞株开发流程，在风险可控前提下，能更快得让产品完成前期开发并进入临床前/临床实验。
本文解读Boehringer Ingelheim(BI)于近期发表在J. Biotech的一篇文献，展示了ATUM的益拼转座子平台如何给细胞株开发流程带来更多的可能性。
往期介绍链接：
高效细胞株开发| ATUM公司的益拼转座酶平台介绍（中文视频）
pk126 编译，可点击文末“阅读原文”。
简介
通过与ATUM合作，引进ATUM的Leap-In转座子平台，BI建立了在其BI-TEX-CHO K1 GS-/-宿主细胞系上的STI（Semi-targeted Transgene Integration）转染技术平台。这种技术让转染成功后的pools具有很高的稳定性，用不到3个月即可逐步放大到2000L的GMP级抗体原液的生产，使转染后6个月内即进入临床实验成为可能。此外，也按当前药典的要求从该pools中筛选单克隆细胞进行建库并逐级放大到12,000L规模生产，对比两种不同模式的蛋白终产品的关键质量属性，结果表明两者高度一致。
结果展示
转染后，建立的稳定pools直接进行放大和建库（此为pools的库），并同步开始pools细胞群分析检测和单克隆筛选建株。其中，Pools细胞经多级放大（不筛选单克隆），可在3个月内完成2000L的原液生产，见图一。
图一：基于转座子技术的Pools至GMP DS/2000L的开发流程
具体而言，转染完成后通过FACS富集，建立了12个pools，通过摇瓶发酵，测定了相关主要参数指标，12个pools的表达范围在93-117mg/L，并且在初期表现出较长的倍增时间（平均值为44h）。综合评价pools产量及细胞活率等参数后，选取红框圈定的pool来进行后续放大生产，见图二。
图二：Pools细胞的主要指标
按GMP标准，对pool进行2000L的Fed-batch生产（8个批次），其终产品表达量达到3.2-3.6g/L，该产能足以满足初步的临床实验。文章作者按GMP级别的流程，选取了部分批次的数据进行公开，数据显示该Pool的放大过程不仅具有良好的放大效果，同时表达出单抗展现了极佳的产品质量和生产过程的稳定性，包括表达量、电荷异质性及糖基化效果等关键性能指标，见图三。
图三：Pools放大到2000L过程的主要参数指标
尽管通过Pool放大到生产，能大幅缩短前期研发开发的周期（从16~24个月缩短到6个月），但是从法规监管的要求需要考虑产品的生命周期，就必须要确保建库细胞来源于单克隆。因此，作者从该亲代Pool中筛选出22株子代候选单克隆细胞株，检测相关数据并与Pool的放大过程进行比较，见图四。
图四：从该Pool中筛选出的22个单克隆的主要指标对比（红点为亲代pool，绿点为11号子代单克隆细胞株）
对比发现，经单克隆筛选后的细胞株其产量均有不同幅度的提升，其余关键参数包括纯度、N-糖基化和电荷异质性等则表现出较高的一致性。
横向比较同一个亲代Pool中经筛选出的不同单克隆细胞株之间的差异，以及其遗传稳定性，发现所有子代单克隆细胞株在终表达量及产率的变化均小于30%（Day37至Day61），重链和轻链的拷贝数范围在10~50 copies/cell（亲代Pool的均值为45 cpc）。通过Southern Blot发现各克隆之间均与亲代Pool保持了高度一致，同时也发现某些单克隆细胞的SB有或大或小杂带，说明随着培养代次增加，CHO细胞涉及目标基因相关区域可能发生随机整合或重排，见图五。
图五：部分候选克隆的主要参数指标
作者从Pool中筛选到的单克隆细胞，按GMP流程完成了建库到12,000L规模生产，时间线见图六；并将其和直接采用Pool（2,000L GMP Grade）放大相比较，研究两者的主要生产质控指标的变化和差异。最终数据表明，在整个生产放大过程中，亲代Pool与其筛选的子代单克隆细胞表现出高度一致：在抗体质量方面，纯度和电荷异质性表现高度一致；N端糖基化有轻微差异（pool~24% vs clone~32%），见图七。考虑到在单克隆筛选中高表达是重要筛选指标，故而筛选所得到细胞建库会比亲代Pool有更高的表达量是理所当然的。
图六：从亲代Pool中筛选单克隆细胞并放大到12,000L生产规模的时间线
图七：亲代Pool放大到2000L与子代clone放大到12,000L的主要指标对比
结论
1.作者通过Leap-In转座酶技术，建立了一种半导向基因整合技术（STI），基于这种技术探索了一种潜在的更为高效的细胞株开发路线，可以进一步缩短从DNA到IND的研发周期。利用转座酶整合相较于传统随机整合，无需变更已有技术平台，简单替代即可实现。
2. 加速DS（Drug Substance）供应。通过pools筛选放大到2000L的GMP级别生产，可直接取代传统的瞬转模式；这种体系还能获得很高质量的目标蛋白，从而可以避免单克隆筛选过程的费时，让企业能更快得到高质量的、GMP级别的目标蛋白。
3. 用稳定的pool细胞库来生成治疗性单抗成为可能。出于产品整个生命周期的考量，法规通常都要求申报用的细胞基质应从单个细胞扩增而来。作者通过Leap-In转座酶技术，建立的稳定pool在细胞间异质性、遗传稳定性等关键检测指标上都展示出了其可满足稳定性及可重复生产的法规要求，还能进一步加快药物从研发生产到临床供应的过程，更符合FIH（First-In-Human ）的精神。
4. 利用转座酶技术完成的基因转染宿主CHO细胞稳定性更佳。本文观察到92%-100%的STI整合细胞株都呈现稳定表达的状态，而随机整合方式（RTI）获得的稳定细胞株比率则在33%-67%之间。并且相较于RTI，STI筛选得到的细胞株表达抗体滴度超过RTI 2倍以上。
参考文献：
J Biotechnol. 2022 Apr 10;349:53-64. doi: 10.1016/j.jbiotec.2022.03.010. Epub 2022 Mar 24. 阅读原文