定量表征治疗性蛋白的结构完整性和稳定性

治疗性蛋白的稳定性直接影响着疗效和患者的安全,因此从药物开发的早期到成药,其结构完整性和稳定性(Structural Integrity and Stability)都是重要的质控指标。现有的蛋白质稳定性分析方法一般是依赖于热变性或化学变性的方法,测定变性温度(Tm)或变性浓度(Cm)等。

在本文献中,提出了一种全新方法,通过在纳米尺度上精确测量蛋白粒径(流体力学半径,Rh)的方法,称之为流动诱导分散分析(FIDA,flow-induced dispersion analysis),在溶液中评估自然状态下蛋白分子的结构完整性和稳定性,一次实验就能得到丰富的数据,仅需要纳克级别的样品,且整个检测流程简便、自动化程度高。


测量原理

流体诱导分散分析(FIDA)是一种基于毛细管的微流控方法,利用毛细管中心的流速比毛细管边缘的流速快的原理,在样品区的头部和尾部产生的径向浓度梯度,导致样品发生扩散,详情可见文末。

当给予蛋白不同浓度的变性剂时,随着变性剂浓度的增加而发生不同程度的变性,蛋白因去折叠产生结构改变,会导致其在层流中的扩散系数(D)也发生改变。FIDA通过检测扩散系数,1)通过Stokes-Einstein方程可得到流体力学半径Rh及其变化,检测结果为绝对值,2)将不同条件下的表观Rh带入相关的数学公式(详见文献),就得到Cm和∆G◦值。

与现有的一些常用的测定蛋白稳定性的方法(DLS、DSC)相比,FIDA在测量时间(一个样品只需6分钟)、样品消耗(仅需纳克级别样品)、数据丰富(一次实验就可以获得蛋白的Rh、荧光强度、 Cm、∆G◦的定量数值)具有优势,同时其全自动进样和运行,无人值守的操作和数据分析能够减少大量的人工和时间。

测量原理图示:

(1)将40nL蛋白样品注入充满0至6M氯化胍(GuHCl)促变性溶液的毛细管中;

(2)给予压力,使毛细管中形成层流,样品逐渐分散到变性剂中。2-4分钟左右,样品和变性剂混合;

(3)采用LED-UV检测样品的分散系数,用于计算样品的流体力学半径。

可以看到,蛋白变性发生去折叠后(6M GuHCL),泰勒峰变得“矮胖”,通过Stokes-Einstein方程可计算得到其Rh增加。


结果展示

在不同pH值和不同浓度变性剂条件下表征HSA和阿达木单抗

HSA

(A)流体力学半径随着GuHCL的浓度增加而增加,显示HSA紧凑的结构随着GuHCL浓度逐渐增加而展开、变性;

(B)内源荧光强度随着GuHCL的浓度增加而下降,表明内部色氨酸和酪氨酸残基暴露导致其内源荧光逐渐减少。

此外,HSA在pH 7和10时的稳定性表现接近;而在pH 4时对变性剂更为耐受,如右移的去折叠曲线所示。

阿达木单抗

(C)流体力学半径随GuHCL的浓度增加而增加,Rh从5.2nm增加到7.9nm;

(D)内源荧光强度随GuHCL的浓度增加而增加,这与HSA去折叠过程中观察到的完全相反。这可以归因于高阶结构和色氨酸和酪氨酸残基数量的差异。

在pH 4时,阿达木单抗最不稳定,而在pH 7和10时表现出相似的稳定性。

       值得注意的是,在以上实验中,每个数据点仅仅只需要40ng的样品!

测量蛋白的变性浓度Cm和折叠自由能∆G◦

将测量得到的各实验组蛋白样品的表观流体力学半径(Rapp)带入相关数学方程可分别计算得到各组蛋白的∆G◦和Cm值。Cm值代表折叠和未折叠蛋白比例相等时的GuHCl浓度,也就是常说的变性中点,Cm值越高。表明蛋白的稳定性越高。表1显示,阿达木单抗通常比HSA更稳定(除了pH 4时)。标准自由能变化(∆G◦(H2O))描述了在给定条件下,如温度、pH和离子强度等,在没有变性剂时蛋白质构象的稳定性。构象稳定性越高,产生的∆G◦越高。


总结

FIDA提供了一种优化的方案,利用TDA结合UV-LED荧光检测来评估从稳定状态到去折叠的蛋白质。这个方法每个数据点只需要40ng蛋白质,每次测量需要6 min(对应于完整滴定曲线的80分钟),工作流程简单,完全自动化,在溶液内自然条件下进行。此外,与现有的方法相比(如DLS、小角度X射线散射法),FIDA能从一次实验中,通过简单的操作,单一的分析软件就可以同时获得多个数据,包括结构特征(Rh)、内源荧光强度和稳定性特征(即Cm和∆G◦)。适用于治疗性蛋白药物早期开发阶段。同时,在蛋白样品极少的情况下,仍可获得高质量的丰富的数据。

FIDA检测原理

流体诱导分散分析(FIDA)是一种全新的生物物理分析方法,利用样品层流在毛细管中心的流速比边缘的快的原理,在样品区的头部和尾部产生径向浓度梯度,导致样品发生扩散。不同的扩散横截面(图A)决定了生成的曲线的形状(图B),结合泰勒分散公式及爱因斯坦斯托克方程,实现了对分子的“第一原理(first principle)”的生物物理学的size测量(流体力学半径Rh)(图C)。

A. 在毛细管中出现的分散分布。该轮廓的形状取决于带有荧光的分子的大小或其与配体形成的复合物大小;

B. 相应的检测器产生的信号峰;

C-D.计算扩散系数D和流体力学半径Rh,可得到分子间相互作用亲和力KD值等。