FIDA应用报告:评估蛋白的稳定性和功能性

FIDA应用报告:评估蛋白的稳定性和功能性

FIDA的主要优势:

• 快速、高通量和可靠地表征HSA蛋白的去折叠(化学诱导)。

• 评估蛋白在去折叠中局部及整体的结构变化。

• 数据与小角度X射线散射法(SAXS)相一致。

• 还可评估蛋白在溶液中的结合亲和力KD、稳定性和粒径的绝对值。

• 仅需微量样品,在样品的自然状态下分析。

• 内置质量控制模块。

前言

本报告基于一篇2019年的经同行评审的论文。1蛋白药物发展迅猛,但也面临着巨大的挑战。蛋白的分子结构比较复杂也不甚稳定,故而其分子、载体和降解物都可能会引发免疫原性反应,导致治疗失效、产生毒性乃至过敏反应。以往的一些蛋白结构表征方法难以在样品的自然条件下检测蛋白稳定性,所需的大量的样本也常难于获得,造成很难规避上述风险。在本报告的工作中,展示了用新一代的方法(流动诱导分散分析,FIDA)测量人血清白蛋白(HSA)的去折叠,以及在自然条件下检测HSA与荧光素结合亲和力的丧失。

FIDA是一种新的基于毛细管的技术,能够在溶液中自然条件下测量分子间的结合亲和力和评估蛋白稳定性。FIDA基于Taylor分散原理在压力驱动的流动系统中精确测定分析物的size大小(编者注:流体力学半径,Rh。),通过测量分析物表观大小的变化(size change)来精确测定结合亲和力和蛋白稳定性。

文献内容示意。

材料与方法

FIDA 1仪器,266nm LIF(编者注:Laser-Induced Fluorescence)和480 nm LED荧光,分别进行去折叠和结合实验(FIDA-TechApS)的检测。采用FIDA标准毛细管(i.d.: 75µm, LT: 100 cm, Leff: 90 cm)。磷酸盐缓冲液67 mM,pH7.4。

去折叠实验:266nm LIF,HSA(0.5mg/mL)作为指示剂和分析物,在0-7M 的尿素浓度梯度中测量其内源荧光的变化。

去折叠实验过程示意。

结合实验:480 nm LED,在0-4M尿素溶液中,荧光素为指示剂(10 nM),HSA为分析物(0-500 µM);首先将分析物充满毛细管,然后注入39nL指示剂,在400 mbar下,随分析物一起进入检测器。

结合实验过程示意。

结果

尿素诱导的HSA去折叠

FIDA可测量流体力学半径的绝对值,在本实验中用来检测HSA去折叠后的整体变化。HSA具有内源荧光,当HSA的结构改变时,测得的内源荧光强度降低;低分子量配体荧光素可与HAS的domain IIA区域结合,当HSA失去功能(该功能区域结构改变)时,结合力下降乃至丧失;在不同浓度尿素下,利用上述原理来检测蛋白局部和整体结构的变化和功能性。

在25℃时,随尿素浓度(0-7M)的增加HSA大小(流体力学半径)的变化见图1A。可以看到,当尿素浓度增加到4M时,HSA开始去折叠,其Rh大小由3.5 nm增加至6.2 nm,此结果与用SAXS(小角度X射线散射法)的检测结果相一致。

图1A:当尿素浓度增加到4M时,HSA开始去折叠,检测结果与SAXS相一致。

利用FIDA泰勒图的峰面积检测尿素浓度增加时HSA內源荧光的强度变化。结果表明当尿素浓度达到1.5 M时,HSA内源荧光强度已开始受到影响,证明该蛋白局部结构的改变发生在整体去折叠之前(图1B)。能够同时测量蛋白局部和整体的结构变化是FIDA的独有功能。

图1B:HAS的内源荧光泰勒峰面积和尿素浓度的函数关系。

HAS和荧光素结合的丧失

0-4 M尿素浓度下,荧光素与HSA之间相互作用的结合曲线(图2),KD值如表1所示。复合物的结合亲和力随着尿素浓度的增加而下降,因此与HSA的去折叠和功能丧失相关。

图2:0-4M 尿素浓度下,HSA与荧光素相互作用的结合曲线。

表1:75℃,pH7.4,不同浓度尿素下HSA与荧光素结合的KD

结论

全面了解蛋白质的稳定性和功能需要结合不同的技术方法。FIDA是一种多层次的方法,能够详细描述蛋白质变性和去折叠过程,如尿素诱导的HSA去折叠。只需一台仪器和极少的样本量,通过测量流体力学半径,表征蛋白质去折叠的局部和整体结构变化,FIDA可用以深入地评估蛋白质的活性。