筛选纳米抗体生产克隆

FIDA设备在此应用中的优势:

• 在克隆筛选的早期阶段即可进行蛋白亲和力检测

• 在培养液中直接检测蛋白表达水平和KD

• 样品为天然蛋白,无需表达His或其他标签

Fidabio克隆筛选试验:无需纯化直接在培养液中检测蛋白表达水平和亲和力

前言

克隆筛选是蛋白药物生产中的重要步骤,筛选的关键参数有蛋白的表达水平、靶点的亲和力(KD)和蛋白的完整性(Rh,流体力学半径)等。在本应用报告中展示了一种新的方法,用于筛选生产纳米抗体的最佳克隆(nanobodies,VHHs)。VHHs是来自羊驼的抗体片段,由于其开发和生产相对简单,故而在蛋白、诊断和治疗性抗体的研究开发中越来越受欢迎。

VHH克隆目前常用ELISA或SDS-PAGE进行鉴定,这些方法准确性较低,所得的信息量也较少,对样品纯化的要求则比较高,这些局限都阻碍了纳米抗体开发的进展。本文介绍了一种新的方法,其优点是将蛋白亲和力作为筛选标准,并可直接在培养基中评估蛋白的表达水平,无需纯化或在提前在VHH上加上表达标签。

通常在克隆筛选的早期,评估KD的挑战是各候选克隆的蛋白表达水平未知。FIDA技术通过测量纳米尺度的流体力学半径(Rh)的绝对值和其变化,来监测分子间的结合相互作用。将Rh的增加作为分子间结合增加的量度,其中结合的增加则可能是高表达水平和/或高亲和力的结果。这种绝对值读数以纳米为单位,提供了分子复合物的粒径大小(Rh)与游离抗原/结合抗原的数量比之间的相关性(编者注:简单理解即是Rh越大,抗原结合的越多,反之亦然)。

因此,利用FIDA技术可先根据Rh(分子复合物的流体力学半径)的大小去筛选出TOP克隆/蛋白,随后去检测这些候选孔的KD。KD的评估方法则是将已知数量的荧光标记抗原与固定体积的VHH生产细胞的上清液/裂解液混合,然后用已知浓度的未标记抗原(多个浓度梯度)去滴定上述混合物。这种竞争性分析能提供Rh大小和KD之间的相关性,且无需纯化直接检测即可。

图1 Fidabio克隆筛选试验的工作流程示意。

材料与方法

FIDA原理:流动诱导分散分析(Flow Induced Dispersion Analysis,FIDA)是一种基于毛细管的微流路检测方法。毛细管中心的流速比边缘快,因此流体在扩散的前端和尾部产生出径向浓度梯度,通过检测其中指示剂(indicator)的荧光信号即可实现“第一原理”的分子生物物理尺寸的测量(编者注:“第一原理”指检测所得为绝对值,意味着无需标准品做对照或需要设备校准,更多原理介绍请参考往期内容),FIDA目前已广泛应用于生物分子稳定性、相互作用等方面的研究。本报告的分析原理如图2所示。

仪器型号:Fida 1,480 nm LED荧光检测;Fidabio标准毛细管(内径:75µm,LT: 100 cm, Leff: 84 cm)。样品形式为Fida 96孔微量滴定板。

指示剂(indicator):含有恒定的标记抗原(Ag- alexa)和不断增加的未标记抗原(Ag)的混合物,用10%空白(不含VHH)培养液进行稀释。

分析物(Analyte):10% 表达VHH的大肠杆菌培养液,未经纯化。

分别以15、30、60、125、250、350、500、1000、2000 nM的未标记抗原滴定每个候选VHH克隆。

Fidabio克隆筛选试验:先用6µL分析物填充毛细管,然后注射39nL标记抗原+未标记抗原的混合物(指示剂),其中未标记抗原有不同的梯度浓度,标记抗原则保持恒定。

图2 实验流程示意。

结果

Fidabio克隆筛选实验分为三个步骤:

步骤1 -按分子复合物流体力学半径(Rh)的大小,对整板96个克隆排序,选出最高值的8个TOP克隆(抗原亲和力高 和/或 亲和力强);

步骤2- 对8个TOP克隆进行非标记抗原竞争性试验;

步骤3 -对生产的产品准确表征蛋白表达水平和VHH亲和力。

步骤1 对96个VHH克隆按Rh大小进行排序

Fida 1的优势之一是精确地在纳米尺度上测量出Rh的绝对值(y轴),揭示出有多少比例的所检测蛋白发生了结合。单独的标记抗原测量值为2.8 nm,标记抗原与VHH复合物的大小为3.6 nm ,所有VHH克隆在本研究中测得的大小都相同(图3)。流体力学半径还可以作为质控检查的一个指标,因为蛋白降解会导致分子半径大小的变化和/或失去结合能力。如果某个克隆的检测值为3.6 nm,意味着结合是饱和的,要么是因为蛋白有高水平表达,要么是因为该纳米抗体有高亲和力,或者是两者的综合结果。

图3 测量结果的上下限。标记抗原 2 nm(左),抗原和VHH复合物3.7 nm(右)。

图4为96个克隆的排序,红色为8个最高的读数。该检测过程采用96孔板自动化完成。选择红色标记的候选孔进入步骤2。

图4 单点大小排序。本实验中,样品混合在毛细管中自动完成的。

步骤2 对8个候选克隆进行Fidabio竞争性试验

对于候选克隆进行竞争分析,将梯度浓度的未标记抗原样品分别滴定入10%的克隆培养液中(图2)。

未标记抗原与标记抗原进行竞争,随着未标记抗原数量的逐渐增加,复合物的表观半径则逐渐变小(图5B)。

图5A为对8个候选克隆进行竞争Fidabio实验得到的反向结合曲线,该曲线用软件中的Fidabio克隆筛选模型进行拟合。

图5B是其中一个候选克隆原始数据的真实示例。由于表观半径的大小(Rh)与结合比例有关,因此可以同时评估特定克隆的亲和力和VHH表达水平(培养液中的纳米抗体浓度)。

图5 对8个候选克隆进行Fidabio克隆筛选试验(A),以一个克隆为例的Fidabio筛选结合曲线(B)。在本实验中,检测设计为定量1 nM – 500 nM范围内的KD值。

步骤3 对筛选出的最佳VHH克隆进行准确表征

在步骤2中,根据亲和力和表达水平确定出了最佳克隆,随后则可进入大规模生产和纯化阶段。用纯化的VHH作为分析物(Analyte),可以利用Fida 1对其进行精确的亲和力表征。在此步骤中,实验不再在10%的培养液中进行,而是在20nM NaHPO4, pH7.4, 140μM NaCl, 0.03% Pluronic F127中进行。

图6显示的是步骤2中筛选出的最佳VHH克隆的结果。在这里,亲和力表征以标准的FIDA实验进行,荧光标记抗原保持20nM恒定,用梯度浓度0.125 nM到100 nM的纯化的VHH依次进行滴定。所选克隆的亲和力测得为2.2 nM。

此外,还可以利用Fida 1数据分析软件中的“Rh预测器”,将复合物的半径大小与蛋白数据库中的结构数据进行比较。

图6 步骤3,标记抗原 (20nM恒定)进行标准滴定,VHH浓度梯度从0.125 nM至100 nM。

结论
Fidabio克隆筛选试验可以在纳米尺度精确检测和得到绝对值,因此,

i)在筛选阶段的早期,即可采用候选蛋白的功能性参数(亲和力)来提高筛选效率,而不仅仅依赖于蛋白表达水平。

ii)筛选时样品无需纯化。

iii)样品可为天然蛋白,无需加入His-或其他标签。