高通量、定量表征液-液相分离(LLPS)

丹麦技术大学提出了一种全新的定量表征LLPS的方法Capflex。与光漂白荧光恢复实验(FRAP)这类定性实验不同,其可以高通量、快速和准确地定量LLPS的多个关键参数:轻相浓度,相对液滴大小分布,以及液滴的形成和成熟为淀粉样原纤维的动力学。

FIDA技术的特点和优势有:

 1. 提供LLPS关键参数的量化数据。

  Capflex利用Fida1仪器,可以检测到每一个液滴和基线的荧光信号值,仅通过一次实验,就得到轻相浓度及液滴大小分布。同时可轻松监测液滴形成或成熟为淀粉样原纤维的形成动力学。

 2. 仅需微升级别的样品。

 3. 仪器可承载2个96孔板,实现高通量表征LLPS。

Capflex方法的原理

    图示:Capflex原理示意。

    仪器FIDA 1包括一个温度控制的托盘,可容纳2个96孔板,使样品温度保持在云点(cloud point)之上。设置好进样程序后,可控温的毛细管自动吸入样品,同时保持样品温度在云点之下,促进样品发生LLPS,随后利用压力推动毛细管中的样品使其到达探测器,记录每一个液滴的荧光信号值。信号基线荧光强度水平代表着轻相(light phase)中的蛋白质浓度。该方法目前能够检测YEP、488及内源荧光。Fida 1仪器配置的检测器十分灵敏,能够检测纳摩尔(nM)级别的样品。

    接下来,介绍文献中通过Ddx4n 1 LLPS和α-Syn LLPS系统量化表征蛋白LLPS的各关键参数。

定量表征蛋白LLPS

    Human DEAD-box helicase-4(Ddx4n)蛋白是一种参与精子和卵细胞形成的蛋白质,其n1结构已被证明能够发生可逆的LLPS。

    首先,利用YEP标记Ddx4n1蛋白,再进行标准曲线校准(左图),可以看到蛋白的浓度和检测到的荧光强度成正相关关系。然后再利用不同浓度的LLPS诱导剂PEG 3000(2%-7%)来诱导蛋白不同程度的LLPS。每一个峰代表着一个液滴(中图)。随着诱导剂的浓度增高,基线荧光强度明显下降(右图),表明越来越多的蛋白质从可溶性的轻相进入到了液滴状的密相中,这意味着蛋白发生了更高程度的LLPS。

随后,利用Fida 1仪器记录下的每一个液滴的荧光信号值,来量化液滴大小和分布情况。随着PEG3000浓度的增加,液滴峰值中位数变大,分布范围变宽,这反映出了液滴大小的中位数与分布的变化。这一结果与共聚焦荧光显微镜观察到的结果一致。

Capflex监测LLPS发生的初始动力

    在温度、浓度、pH等条件相同的情况下,给予50µM的Ddx4n1不同浓度的PEG,通过Capflex可以观察到在2% PEG3000条件时,液滴的形成略有延迟,随着PEG3000浓度的增加,对应的LLPS的驱动力较大(上图)。3%和4%的PEG3000,在1.5 min后达到最大峰值强度,液滴的初始增长速率显著减慢(下图)。

   测量分子的水力学半径(Rh)和分子相互作用的亲和力,是Capflex使用的仪器Fida 1最具特色的功能之一,如感兴趣可点击这里阅读相关的应用。实验人员利用ssDNA和Ddx4n1上验证了这一功能。

利用0-30µM的ssDNA对128µM的Ddx4n1(已发生LLPS,10%荧光标记蛋白)进行滴定,从左上图可以看出,随着ssDNA浓度的增加,Ddx4n1的轻相浓度逐渐增加,之后逐渐接近总蛋白浓度,液滴分布的中位数和宽度也逐渐减小(右上图),这表明了ssDNA降低了Ddx4n1发生LLPS的驱动力。那么ssDNA是否如之前的报道那样,进入到液滴中呢?为了验证这一点,实验人员将标记策略反过来,用 Alexa488标记ssDNA,0-30µM总浓度ssDNA滴定112µM未标记的Ddx4n1,从左下图可以看到,0-6µM时,轻相中ssDNA的浓度下降,6-30µM时,轻相ssDNA浓度又开始上升,液滴大小的分布宽度减小,这意味着,ssDNA曾进入到液滴中,6µM的ssDNA的条件下,Ddx4n1 LLPS系统的液滴开始溶解,表明6µM的ssDNA是一个临界值;当ssDNA达到26.6µM时,液滴完全溶解。

用0-100µM的ssDNA(分析物,analyte)对Ddx4n1-YEP(指示剂,indicator)进行滴定,可以得到Ddx4n1-YEP的水力学半径(Rh)为3.5nm,与ssDNA的KD为50.9±11.1µM。从图中我们可以观察到,复合物的Rh增长超过了7.5nm,增长幅度超过了一个ssDNA的尺寸,这表明ssDNA与Ddx4n1的结合并非1:1结合。

Capflex不仅可以表征蛋白质的LLPS,还可以表征小肽的LLPS
    RP3肽在ssDNA存在时,能发生LLPS,同时在某些情况下会凝聚成中空的球形。

用Alexa 488标记ssDNA,再分别加入3.3-40µM的总ssDNA,用Capflex技术检测。在极低浓度的ssDNA(3.3µM)下,可观察到的尖峰(液滴开始形成);当ssDNA浓度增加到13.3和33.3µM时,我们可以观察到大量的液滴形成;40µM时,观察到峰,这表明过量的ssDNA抑制了RP3的LLPS。

共聚焦显微镜的结果显示(左图),高RP3/ssDNA比例时,液滴非常小,表明可能处于发生LLPS的临界值;中等RP3/ssDNA比例时开始形成LLPS,20℃孵育20分钟后,液滴进一步增多;低RP3/ssDNA比例时,没有观察到任何液滴。接下来,使用Fida 1仪器测量ssDNA与RP3的亲和力,结果(右图)显示ssDNA的Rh为2.3±0.2nm,用0-100µM的RP3肽滴定后,随着肽浓度的升高,观察到的Rh逐渐下降,最终接近0.8nm,表明DNA结构的强烈崩坏。这一结果凸显了1kDa带正电荷的RP3肽对10kDa带负电荷的DNA的强电荷中和作用。

综合Capflex和共聚焦显微镜得到的数据表明,RP3LLPS在很大程度上依赖于肽与ssDNA的化学计量比。当RP3丰富时,ssDNA可以通过与肽的静电相互作用诱导LLPS。然而,在非常高的ssDNA浓度下,RP3会发生完全的电荷中和,这不利于凝聚与LLPS的发生。

Capflex还可以表征液-固相变

据报道,α-突触核蛋白 (α-Syn) 能够发生 LLPS ,随后可以由液相转变为固相,从而导致淀粉样蛋白原纤维的形成,这一过程可能是病理性的[2]。

在100µM的α-Syn溶液中加入10nM的Alexa488标记的α-Syn与20%PEG6000,37℃孵育,每隔4小时(48小时)进行Capflex测量。在每个时间点,用缓冲液稀释样品,并使用Capflex检测液滴的可逆性(重新混合后信号峰值的消失表明其可逆)。在0h时,没有观察到峰值,这表明样品没有相分离;孵育4-8小时后,开始出现小而稀疏的峰,轻相浓度下降,这时相分离开始了;6h后,α-Syn相分离成液滴,稀相浓度下降到70µM,直到24h时几乎保持不变;当孵育时间达到30-48h时,即使在稀释样品后,信号峰值也没有消失(右图)。48h后,基线荧光达到2-5µM,表明α-Syn在指数相中发生了不可逆的液固转变和聚集。

用5µM ThT标记上述样品,通过Capflex(左图)和共聚焦显微镜(中、右图)监测不同时间点(48h内)α-Syn淀粉样蛋白聚集(ThT为硫磺素T,被标记的蛋白发生淀粉样变时,会在显微镜下显现蓝色的荧光,右图)。Capflex的ThT通道结果显示,0-10小时内没有观察到峰值,这表明没有淀粉样原纤维的形成;24h的样品出现少量的峰,可能是由于开始出现淀粉样蛋白聚集所致;30-48小时,ThT通道的基线浓度显著增加,信号出现峰值,表明存在ThT阳性的淀粉样蛋白聚集物(左图)。共聚焦显微镜的结果显示,488通道下,24-48h液滴逐渐变大(中图);ThT通道下,30h后液滴中染料的荧光增强,表明存在淀粉样蛋白聚集物(右图),48h后,发现液滴更具粘性,开始出现纤维形态。

通过 plate reader aggregation分析,α-SynLLPS溶液(100µM)发生LLPS的滞后时间为20-24小时;指数聚集阶段在孵育20-24小时后开始,并持续50小时到饱和(左图)。Capflex的数据清楚地表明,这种新的定量方法可检测到α-Syn发生LLPS的开始对应于蛋白聚集的滞后阶段。不可逆的液-固相变和淀粉样蛋白聚集主要发生在指数阶段(20-40h),这可以通过稀释相浓度的进一步降低和30h后的ThT阳性信号峰值得到证实。

结论

越来越多的证据指明,LLPS在众多生理过程和疾病中扮演着重要角色,存在各种实验方法来检测液滴的形成(如显微镜、浊度检测、FRAP)、量化液滴尺寸分布(显微镜)和稀释相浓度(UV-Vis吸收光谱)以及绘制完整的相图(例如 microfluids water-in-oil emulsion droplet systems)。然而,大多数这些方法都存在一些不方便的地方,如低通量(显微镜)、样品需求量大(离心后直接测量稀释相浓度)或高技术障碍(微流体)。全新的Capflex可以定量上述所对于研究LLPS来说至关重要的参数,同时能实现高通量(能承载2块96孔板),可控温,全自动上样,无需人员值守。