溶液中蛋白的聚集状态如何?

蛋白间相互作用通常涉及多重结合、亲和力、聚集(寡聚)、溶液环境等多个参数,而现有的分子互作方法难以提供详细的机理表征。尤其是当需要动态表征三个或以上的组分形成的复合物时,事情就会“复杂”到无能为力,因为没有结构相关的数据来指示动态形成的、不同组合的复合物。

Fida 1能够在溶液中直接检测蛋白复合物的粒径(Rh,流体力学半径),检测结果为绝对值,可得到准确可靠的定量数据,进而分析出蛋白聚集体的真实状态。

阅读原文

本文介绍了一个实际例子,利用FIDA技术在类似体内条件下的溶液中,表征TNF-α和adalimumab之间的相互作用。

对蛋白间相互作用的理解和表征有助于阐明复杂的生物分子过程和开发新药,这通常涉及多重结合、亲和力、聚集(寡聚)、溶液环境等多个参数,而现有的分子互作方法却难以提供详细的机理表征,这是因为:这些方法常常需要将其中一个蛋白固定在芯片或探针的表面,而不是在生物相关的条件下测量;而且,当需要动态表征三个或以上的亚基或配体间形成的多重复合物时,事情就“复杂”到无能为力,因为没有结构相关的数据来指示动态形成的,不同组合的多重复合物;或者,测得数据不是绝对值,在测量原理上就和多个因素相关,因而数据难以重复和令人怀疑。

蛋白聚集(寡聚化,oligomerization)的产生并不是特例,而是一种常态,很多蛋白都是由多个亚基组成的。不同蛋白亚基间的联接有强弱或松紧的差别。在某些情况下,蛋白聚集取决于一些环境条件,如浓度、温度和pH值; 而另外一些时候,受到某种刺激后蛋白会发生动态聚集,如蛋白或核苷酸的结合、水解或翻译后修饰(如磷酸化和糖基化)。在研究蛋白功能的控制如变构调节、稳定性和高阶复合物的形成时,蛋白寡聚化(Protein oligomerization)是一个关键的参数。

在此文献的工作中,使用流动诱导分散分析(FIDA)在类似体内条件下的溶液中,表征TNF-α和adalimumab之间的相互作用。FIDA是一种无需固定的配体结合表征方法,采用泰勒分散分析来测量生物分子复合物的流体动力学半径(size)。在这个工作中,检测和研究了浓度依赖的复合物粒径大小(Rh)、结合亲和力(Kd)、动力学和更高阶的化学计量学,从而提供了TNF -α-adalimumab结合机制的基本信息。此外也表明,涉及形成多个非共价键的亲和力稳定的复合物所需时间,要比初级复合物(简单的1对1结合)要长。

图1:TNFa-alexa488(三聚体3.2 nm)与adalimumab在磷酸缓冲液中以nM亲和力结合,0.067 M, pH 7.4, 0.1% HAS, Kd = 1.5nm,复合物尺寸:8.9 nm。

图2:TNFa-alexa488(三聚体3.2 nm)在10和20% v/v的人血浆中与adalimumab结合,磷酸盐缓冲液,0.067 M, pH 7.4, 0.1%HAS, Kd = 1.0 – 1.7 nm,复合物尺寸:8.7-9.7 nm。

图3:显示了流体力学半径(nm)随着缓冲液pH也即氢离子(H+)的浓度变化时的变化。

表明蛋白从单体状态向低聚体的pH依赖性转变。单次测量。R2 = 0.993, Rh(单体)= 1.08 nm, Rh(聚集体)= 3.19 nm。

图3:显示了Adalimumab不同浓度时,和TNFa-alexa488能形成的各种复合物和比例。

Pedersen, M.E., Haegebaert, R.M.S., Østergaard, J. et al. Size-based characterization of adalimumab and TNF-α interactions using flow induced dispersion analysis: assessment of avidity-stabilized multiple bound species. Sci Rep 11, 4754 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84113-z

FIDA技术的特点和优势有:

1.可以定量确认蛋白聚集体的状态

Fida 1可检测不同浓度、PH、缓冲液等条件下特定聚集体的粒径绝对值,可通过分析聚集和浓度等条件之间的依赖关系,研究蛋白聚集的趋势。

2.能够直接用复杂溶液进行分析

复杂的环境可能触发蛋白聚集作用,在生产特定聚集状态的蛋白时,使用Fida 1可以使用血浆、血清、细胞裂解液、发酵培养基等样品直接测量。

3.还可检测温度对聚集状态的影响

Fida 1温度控制范围可从5到44摄氏度,精确可达0.1°c,便于研究温度变化对聚集反应的影响

参考文献:

Pedersen, M.E., Haegebaert, R.M.S., Østergaard, J. et al. Size-based characterization of adalimumab and TNF-α interactions using flow induced dispersion analysis: assessment of avidity-stabilized multiple bound species. Sci Rep 11, 4754 (2021).

阅读原文