分子胶诱导蛋白降解的新机制

Monte Rosa是一家专注于蛋白降解疗法的新锐生物医药公司,成立于2018年,其开发了一个专有的技术平台 QuEEN,公开资料显示平台化学库预计将有 10,000 多个用于泛素连接酶重编程的结构。基于该平台,Monte Rosa 开发出了一系列分子胶在研管线,适应症包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、炎症、自身免疫疾病等。其中口服分子胶降解剂 GSPT1 管线进展最快,预计在 2021 年下半年启动 IND 研究,并在 2022 年上半年向 FDA 提交IND。

Monte Rosa Therapeutics已购置了Fida 1系统,用于分子胶的体外表征。FIDA技术在靶向蛋白降解剂开发中具有独特的优势,可以检测和表征:

1)靶蛋白,E3连接酶尺寸大小的绝对值和完整性(Size and Integrity);

2)三元复合物的结合亲和力(Binding Affinities);

3)三元复合物中靶蛋白结合的比例(Fraction of POI);

4)协同性(Cooperativity )

分子胶目前在靶向蛋白降解(TPD)领域的定义,是一种单价小分子(<500Da),能通过重塑E3连接酶受体的表面促进新底物蛋白(neosubstrates)的募集,进而推动新底物蛋白的泛素化和随后的被蛋白酶体降解。目前,在TPD中已成熟应用的分子胶有:

a)结合E3酶cereblon的免疫调节“IMiD”类小分子;

b)结合DCAF15的芳基磺酰胺类(aryl sufonamides)小分子。

由于这些分子胶无需感兴趣的蛋白上有结合袋,因此可用于以往难以成药的靶点。由于具有催化作用和靶向非酶蛋白的能力,分子胶作为一种治疗药物有着特殊的应用前景。1 到目前为止,TPD中的分子胶降解主要依赖于招募E3连接酶受体,但近期的三项研究又开辟了分子胶诱导新底物蛋白降解的新领域。

为了发现能诱导降解的新药,Slabicki等人研究了一些临床前和临床药物之间的相关性,这些药物导致的细胞毒性都与E3连接酶机制有关。2 研究发现,CR8(一种泛CDK抑制剂,其细胞毒性与DDB1蛋白有关)可诱导细胞周期蛋白K(cyclin K)的选择性降解。DDB1(Damage-specific DNA Binding protein 1,损伤特异性 DNA结合蛋白 1)是一种衔接蛋白(adaptor protein),协调E3酶底物受体和CUL4A/BRBX1连接酶核心间的相互作用(图1A,中)。通过大量功能基因组学分析,研究者确定了CR8诱导cyclin k降解所需的DDB1复合物的具体组成:CUL4B, NEDD8, UBEA3和RBX1。然而,他们却没找到E3连接酶的底物受体,而这通常是底物泛素化的关键。相反,他们发现CDK12是cyclin K降解的关键分子,而CDK12是一种和E3连接酶无关的CR8结合剂。通过Pull down 和 TR-FRET 进一步研究发现, CDK12 对 DDB1 的亲和力本来非常弱,但在 CR8 存在的情况下,亲和力则增强了 500-1000 倍。研究者解析出一个3.5 Å分辨率上的DDB1-CR8-CDK12复合物晶体结构,该复合物有一个长2100 Å的牢固的蛋白-蛋白间结合界面,该界面通过CR8桥接。结构分析表明,CR8通过其疏水的苯基吡啶环体系与DDB1的BPC(beta-propeller C)结构域作用,正是该结构域将cyclin K定位于通常由降解底物占据的连接酶泛素化区(图1A,底部)。有趣的是,类似结果也被其他两个独立研究小组所报道1,3, 这进一步证实了这些分子胶绕过了E3连接酶底物受体的需求,劫持了E3酶衔接蛋白DDB1并诱导靶蛋白降解。(拓澳编者注:迄今为止,分子胶降解剂仅被证明与E3连接酶结合去募集底物,而在本研究中,CDK12并不是E3连接酶的组分,却充当了类似底物受体的作用,将DDB1连接到底物靶标cyclin K。因此绕过了对DCAF的需求。这项研究表明,化合物诱导的蛋白-蛋白相互作用可能比人们先前所认识到的的更为普遍,也提示修饰结合靶标的小分子的表面暴露区域是一种合理的策略,可用于开发特定蛋白靶标的分子胶降解剂。DCAF:DDB1 CUL4 相关因子。Mikoaj Slabicki  et al.,Nature)

图1所示。几种无需招募E3酶受体的分子胶降解新机制。

(A) CR8通过劫持E3连接酶衔接蛋白DDB1(而非E3酶底物受体DCAF),将cyclinK定位于泛素化区,促使其被蛋白酶体降解。

Slabicki等人的第二项研究发现诱导聚合(polymerization)是分子胶诱导降解的另一个新机制。4 在筛选BCL6抑制剂时(B-cell lymphoma 6 protein,拓澳编者注:BCL-6作为一种转录抑制因子,对B细胞生发中心的发育和功能维持起着重要的作用,使生发中心的B细胞迅速增殖,逃避生长检查点的控制,并能承受较高水平的DNA损伤,BCL-6的表达失控将会直接导致B细胞淋巴瘤的产生,因此BCL-6被认为是弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗靶点。),意外发现一种BCL6抑制剂BI-3802诱导了BCL6的降解,而BI-3802的类似物却没有。通过荧光显微镜研究BI-3802诱导聚合的现象:用BI 3802处理表达eGFP BCL-6的细胞约10分钟,可使eGFP指示的位点在100分钟内降解消失。此外,在有BI-3802存在时,尺寸排阻色谱分离后得到了一些更高的分子量的物质,但BI-3802的类似物没有。值得注意的是,有BI-3802存在时,纯化出的BCL6在负染电镜下形成一种正弦形丝状结构。冷冻电镜结构(3.7 Å) 则表明BI-3802结合在BCL6的Bric-a-brac (BTB)̀结构域二聚体之间的凹槽,主要通过疏水相互作用来促进聚合(图 1B)。而BI-3802类似物的溶剂暴露基团存在一些轻微的修饰,阻碍了聚合,故而其不能诱导BCL6降解。此外,研究者发现E3酶SIAH1能识别BCL6的聚合物并促进其泛素化和降解。免疫沉淀研究则表明,在没有 BI-3802 的情况下,SIAH1 也能与 BCL6 相互作用,但在该分子胶存在时,两者间的相互作用就会大大增强。因此,该分子胶的机制是通过触发BCL6的聚合,增加了BCL6与同源 E3 连接酶的结合,进而促进其降解。(拓澳编者注:BI-3802与BCL6的BTB域结合会触发BCL6的高阶组装,这是一类新的靶向蛋白降解机制,即小分子药物通过诱导聚合和随后的降解来使靶蛋白失活。)

图2所示。几种无需招募E3酶受体的分子胶降解新机制。

(B) BI-3802诱导BCL-6BTB结构域发生聚合,而聚合增强了对同源E3连接酶的募集,进而促使其降解。

在第三种更直接的方法中,Li等人(拓澳编者注:复旦大学生命科学学院鲁伯埙教授课题组)使用微阵列芯片筛选识别小分子,这些小分子能选择性地诱导突变的亨廷顿蛋白(mHTT)与LC3相互作用,LC3是一种选择性结合自噬底物过程中的关键蛋白组份(图1C)。5 虽然蛋白酶体能有效降解大多数的蛋白,但却不能有效地识别体积庞大和聚集的底物。因此,通过自噬降解是一种更适合的办法。(拓澳编者注:LC3,自噬小体蛋白微管相关蛋白1A /1B轻链3。在蛋白水平上,亨廷顿症HD中存在大量由变异基因表达的突变蛋白,突变蛋白mHTT的累积则是引发HD的主要原因。如何降低mHTT?巨噬细胞自噬是一种独立的蛋白质降解途径,可将蛋白质包裹进自噬小体,随后进行溶酶体降解。自噬存在于所有真核细胞中,因此利用自噬能力降解某些靶蛋白可能具有发现药物的潜力。作者提出假设:与LC3和致病蛋白都相互作用的小分子化合物,可选择性对致病蛋白进行自噬清除。)鲁教授课题组筛选鉴定出了2个化合物(10O5, 8F20),可与LC3和mHTT相互作用,但与野生型HTT蛋白没有相互作用,能够选择性地诱导突变亨廷顿蛋白的降解,称之为自噬小体绑定化合物 (ATTECs)。ATTECs通过结合突变蛋白特有的一个有72个谷氨酰胺(Q)的polyQ片段来实现选择性。(拓澳编者注:野生型蛋白wtHTT和突变mHTT结构上的区别在于polyQ片段的长度,wtHTT的polyQ<36Q,而mHTT的polyQ≥36Q。研究发现,偶联化合物可与扩展的polyQ片段特异性相互作用,实现靶向性降低mHTT,但不影响wtHTT。Li, Z.,et al。,Nature) 在细胞中,这些化合物定位于LC3B阳性自噬体,并在原代培养的新皮层神经元和果蝇模型中诱导了mHTT的降解。此外,抑制重要的自噬介质可破坏ATTECs的功能,证实了其作用机制。有趣的是,作者还观察到一种钩子效应(hook effect),这本来是一种与异双功能PROTACs分子相关的现象,在较高的化合物浓度时,二元复合物(LC3:ATTEC或ATTEC:mHTT)较之三元复合物(LC3:ATTEC:mHTT)更占优势。可见,ATTECs的大小和行为使其成为了一种独特的类别,介于传统分子胶(<500Da)和PROTACS(独立参与靶标和E3酶的结合)之间。当然,仍需要更多的生物物理学和结构学研究来巩固其所提出的机制。

图3所示。几种无需招募E3酶受体的分子胶降解新机制。

(C) ATTECs如10O5将LC-3连接到mHTT上,促进突变蛋白与延伸的自噬前体(elongating phagophores)的结合,之后通过自噬予以降解。

上述三项研究揭示了分子胶诱导特定靶蛋白降解的新机制,进一步丰富了药物开发的可能性。CR8的发现表明CRL4 E3连接酶复合物比之前预期的更容易重编程,而且E3底物受体以外的其他E3酶组分也可被借用,来定位靶蛋白到相应的泛素化区。CR8研究的意义还在于,创造性地提出药物的靶点不一定也是泛素化的靶点。对BI-3802的研究则表明,由于其诱导的蛋白聚合与淀粉样变性等蛋白质病中观察到的聚合或聚集相似,因此这可能是一种可行的药物开发途径,招募蛋白质同源的E3连接酶并导致其降解。在这个例子中,“粘合”的能力是通过在溶剂中暴露的疏水基团来实现的。而在溶剂暴露区域的微小化学修饰或蛋白质界面的突变就会导致靶蛋白完全不能被降解,这突出了分子胶的挑剔性。一方面,药物有高度的选择性是一个巨大的优势,但从另一方面看,这也让分子胶的设计和识别都变得极其困难。事实上到目前为止,分子胶基本都是意外的发现,而转向理性设计才能让其普遍地应用。在这方面一些初步的例子已经出现,开发有新功能的分子胶降解剂逐渐有些踪迹可寻,但还是有很多的东西需要去了解。小分子筛选方法如鲁教授课题组鉴定ATTECs的方法,同时结合全面的结构学研究,必将加快理性发现新分子胶的速度,而这些新分子胶完全可以有与以往不同的独特的机制去诱导新靶点的降解。