在血浆和缓冲液中简便准确地检测蛋白寡聚化

Fidabio的主要优势:

•同一方法,在不同条件下表征蛋白的寡聚化状态。不同条件:浓度/pH值/离子强度/温度/是否存在共聚物(co-polymer)。

•直接在血浆中检测蛋白寡聚状态

•针对蛋白寡聚状态进行生产工艺优化

简介

很多蛋白包括许多药物靶点蛋白,唯有在二聚体或寡聚体(oligomers)的形式存在时才处于活性状态。因此,了解什么条件下蛋白会产生寡聚化(Oligomerization)对药物开发、制剂的组成以及生产工艺至关重要。

本应用报告采用一种注射用治疗蛋白进行了一系列分析测试,该蛋白已知在不同条件下会以单体、二聚体和四聚体等形式存在,而其中只有四聚体才可与目标受体结合。由于该蛋白在血液中处于活性状态,故而我们还在90%的血浆中进行了实验,来模拟生理条件。

所有的实验都使用Fida 1仪器进行,本方法能够准确的检测蛋白质的粒径(流体力学半径,Rh)以及在不同条件下粒径的变化。该技术一个突出的特点是“不怕脏”,可以直接在血浆和血清等原始基质中直接分析。本报告展示了Fida 1如何提供蛋白质寡聚状态的真实信息,这在目前是用其他任何方法都难以实现的,进行的测试有:

i)离子强度的影响

ii) pH值的影响

iii)不同样品基质:缓冲液& 90%血浆

图1。检测蛋白(POI)寡聚化原理示意。[POI] =检测蛋白的浓度

材料与方法

Fida 1仪器,480 nm exLED荧光检测;采用Fidabio标准毛细管((i.d.:75 µm, LT: 100 cm, Leff: 84 cm)。流动诱导分散分析:先将分析物(analyte,缓冲液或未标记的POI)充满毛细管,然后注射40nL的POI-alexa488或预先孵育的POIalexa488+POI,在400 mbar压力下向检测器移动。

i)离子强度的影响

醋酸磷酸盐缓冲液的配置:0.03% Pluronic Acid F127, ph5,0;NaCl浓度梯度分别滴定为从0.5到150mM。用25 nM的检测蛋白(POI)作为指示剂(indicator),ThermoFisher Scientific AlexaFluor®488蛋白标记试剂盒标记。

ii) pH的影响

醋酸磷酸盐缓冲液,0.03% Pluronic Acid F127,100 mM NaCl的作用。pH梯度分别滴定到从3.5到7.2不等。25 nM的检测蛋白(POI)作为指示剂, Alexa Fluor®488蛋白标记试剂盒进行标记。

iii)样品基质的影响:缓冲液& 90%血浆

醋酸磷酸盐缓冲液,0.03% Pluronic Acid F127, 100 mMNaCl, pH 5,0。POIAlexa488在10 nM浓度恒定, 未经标记的POI浓度梯度分别滴定为从10nM到16µM, 用标准缓冲液或血浆作为样品基质。

结果

与其他荧光标记技术相比,Fida 1提供了直接测量分散系数绝对值的方法,而分散系数(diffusion coefficient,D)直接与流体力学半径(Rh)相关。(编者注:可参考文末FIDA技术原理)

图2A离子强度的影响,显示NaCl浓度变化对粒径大小的影响。10 nM浓度以下,蛋白以单体存在,显示的表观大小是单体的尺寸。而从10 mM NaCl开始,越来越多的多聚体产生,Rh从3 nm的单体大小逐渐开始增加。10个不同的浓度滴定点的平均误差仅为±0.077nm,即所测量Rh的误差范围仅为1-1.5%之间,数据相当可信和准确。

图2B显示了随着pH值的增加对粒径大小的影响。数据表明,自pH值5以上可以稳定形成Rh为4.9 nm的四聚体,而pH值低于5就会导致四聚体的解离。

图2。(A) 25 nM POI-Alexa488, pH值为5的醋酸磷酸盐缓冲液,NaCl在25℃下从0.5到150 mM滴定,所测得的Rh。(B) pH滴定测得POI-Alexa488的Rh值,pH梯度为3.5 ~ 7.2。

以下几组实验为用Fida 1检测在缓冲液和血浆中寡聚物状态的浓度依赖性。之前试验结果可知,观察寡聚物状态随浓度变化的最佳pH值在pH 5左右。用未经标记的POI(分析物)去滴定标记有荧光的POI(指示剂),滴定后的分析物浓度梯度从0到16 uM,用来检测四聚体的形成与浓度间的关系。

如图3A所示,只有标记的POI时,测量流体力学半径为4.7 nm,之后随着未标记的POI数量的增加而增加。在2 uM时,未标记的POI 在5.7nm处达到饱和,显示所有标记的POI都处于四聚体的形式。缓冲液中检测的误差在1-4%的范围内。

图3B显示的数据显示了与3A相同的检测方法,只是在90%的血浆中检测,而不是在缓冲液中。Alexa488标记的POI现在显示3.7 nm的Rh,接近单体状态。在血浆和缓冲液中,向完全齐聚的转变发生在较窄的浓度范围内,并且已经达到了100 nM的最大尺寸。血浆中最大波长约为6.0 nm,缓冲液中为5,7 nm,其误差在1-10%的范围内。

图3。(A) POI浓度梯度0-16 µM,在缓冲液内检测; (B) 同样条件,在90%血浆中检测。

 结论

已知在许多体系中都会发生蛋白质寡聚化的现象。但在FIDA技术出现以前,很难用同一个方法去表征多种环境参数(如离子强度,pH和样品基质)对蛋白寡聚化的影响。FIDA技术可以轻松可靠地在不同的检测条件下评估蛋白药物靶点的寡聚状态,还可以直接在复杂的样品溶液环境(如血浆)中对蛋白寡聚状态进行检测,故而能够在接近生理条件下表征蛋白和提供重要信息。因此作为一种简便可靠的方法,Fida 1可望广泛地应用于制剂处方开发和日常生产工艺中蛋白条件的优化。