Fidabio的主要优势：
•在溶液中自然条件下测量结合亲和力KD
•测定纳米盘的大小并评估其质量（完整性）
•仅需微量样品
•内置质量控制模块：寡聚和聚集状态的检测
前言
本文研究证明，流动诱导分散分析（FIDA）可以全面表征包埋有β2-ARs的纳米盘与纳米抗体Nb80间的结合。并且，FIDA技术还可同时进行质量控制，如评估样品材料的完整性和受体的寡聚状态。
FIDA是一种基于毛细管的新技术，在压力驱动的流动系统中精确测定分析物的流体力学半径的绝对值，而其表观半径大小的变化是精确测量结合亲和力和蛋白稳定性的基础。
GPCRs
G蛋白偶联受体（GPCRs）是膜蛋白家族中最大的一类，参与许多重要的细胞生理机制，如激素信号转导、细胞周期调控、神经递质信号转导和嗅觉调控等。靶向GPCRs的药物占全球商业化药物的27%。因此，这一领域的新技术将有望带来对GPCR相关疾病的新发现和新的治疗手段。
纳米盘（Nanodisc）
由于膜蛋白存在疏水部分，因此在体外容易聚合，需要一种合适的方法让膜蛋白能够稳定地存在于胞外的环境。纳米盘（也称纳米磷脂盘）是由膜支架蛋白 ( membrane scaffold proteins, MSPs ) 和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。膜支架蛋白 ( MSPs ) 是载脂蛋白 ( apo ) A-I 的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而形成圆盘状的结构，即纳米盘。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得 纳米盘在水溶液中具有很高的溶解度，同时在没有去污剂的情况下也可以使膜蛋白溶解。通过这种特殊的结构，膜蛋白可以整合到 纳米盘中，并保持其生物学活性，为膜蛋白研究提供了有力的技术支持。
图示：膜蛋白组装到纳米盘（Nanodiscs)的原理图。绿色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白。
β2-ARs和Nanobody
β2肾上腺素能受体 (β2-ARs) 是一类G蛋白偶联受体，是研究GPCRs蛋白在信号转导中的作用的理想模型系统；Nanobody即纳米抗体，是基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势。
图1。本文分析系统示意图，该系统由嵌入纳米盘中的β2肾上腺素能受体(绿色)和可与G蛋白结合袋相结合的纳米抗体Nb80组成。
材料&方法
FIDA 1仪器，480nm LED荧光检测结合实验（Fidabio-ApS）。FIDA标准毛细管（内径：75µm，长度：100 cm，Leff：84 cm）。用10 mM pH7.4的HEPES缓冲液，0.5 mg/ml牛血清白蛋白作为工作缓冲液。以纳米抗体Nb80为指示剂（Indicator），用ThermoFisher Scientific的Alexa Fluor®488蛋白质标记试剂盒进行标记。
包埋有β2-ARs的纳米盘作为分析物（ND-β2AR，analyte），滴定为浓度梯度0-1 µM。先将毛细管中充满分析物（4µL），然后注入39 nL的经过预孵育的指示剂+分析物，在400 mbar压力下向检测器移动。
结果
Nb80与活性状态的GPCR结合
FIDA技术可测定Nb80流体力学半径（Rh）的绝对值，并以此来测量标记有alex488的Nb80在与嵌入有β2-ARs的纳米盘结合后半径的变化。异丙肾上腺素（Isoproterenol,IPTR）是一种胞外结合并将GPCR转化为活性状态的激动剂，在10 µM异丙肾上腺素存在下，随着ND-β2AR浓度（0-1µM）的增加，用Nb80表观半径的变化做图（图2A，绿线）。未添加ND-β2AR时的Nb80半径为1.76nm，添加ND-β2AR后，Rh增大至5.25nm，明显表明GPCR和 Nb80间发生了结合。
测得的Rh 5.25nm与已知纳米盘的平均半径5nm相一致。为了证明结合的特异性，另外测量了2个对照组。第一个对照是在10 μM的拮抗剂alprenolol（丙肾上腺素，APNL）存在时检测，该拮抗剂可将受体转化为非活性状态（图2A，橙色点）。第二个对照则是既没有激动剂也没有拮抗剂时测量（图2A，蓝点）。两个对照组的Rh分别测定为3.6和3.4，与5.25相比，显示GPCR在非活性状态下的结合能力显著降低。
图2：（A） Nb80与ND-β2AR的结合曲线，IPTR：异丙肾上腺素，APNL：丙肾上腺素。绘制Nb80的表观Rh与ND-β2AR浓度变化的函数关系图。（B）原始数据显示，由于结合时半径增大，泰勒峰随着ND-β2AR浓度的增加而逐渐变宽。
结论
本报告所提供的数据显示了如何利用FIDA技术在溶液中非侵入地对嵌在纳米盘中的膜蛋白进行功能表征。
除了测量与受体的结合之外，FIDA技术还可以评估GPCRs可能发生的二聚化和多聚化，可测量半径可达500nm的结构如蛋白脂质体（proteoliposomes）。在下一期应用报告中，我们将重点展示FIDA技术如何简单而准确地检测生理条件下蛋白真实的寡聚状态（Oligomerization）。