全面表征PROTAC三元复合物

Fidabio在BiDAC™开发中的独特优势,可以检测和表征:

1.靶蛋白,E3连接酶大小的绝对数值和完整性(Size and Integrity)

2.三元复合物的结合亲和力(Binding Affinities)

3.三元复合物中靶蛋白结合的比例(Fraction of POI)

4.协同性(Cooperativity )

简介

Raymond. Deshaies(美国两院院士)和Craig. Crews等人在2001年最早提出了靶向蛋白降解(targeted protein degradation ,TPD)这个概念,并成功地设计和合成了第一批双功能分子,这在当时只是被当成一个有趣的研究工作(1)。

近20年后的今天,TPD已成为了一种极富前途的治疗方法,吸引了广泛的兴趣和大量的投资。在2015年引发热潮后,Deshaies博士曾发表过一个观点:PROTACs有潜力成为一种主要的新型药物,且可能会超越有史以来最热门的两个药物开发领域—蛋白激酶抑制剂和单克隆抗体

与通常的抑制药物相反,PROTACs触发了一种内源性细胞机制,即靶向蛋白降解,通过泛素蛋白酶系统(ubiquitin-proteasome system)捕获并“杀死”不需要或受损的蛋白质。PROTAC是 PROteolysis TArgeting Chimera的缩写,称之为蛋白降解靶向嵌合体,这是一种由三个部分组成的双功能小分子,一端结合靶蛋白,另一端结合E3泛素连接酶,通过一段linker连接,形成三元复合物(Ternary Complex)。在体内可以将感兴趣的靶蛋白(POI,protein of interest)和E3酶拉近,使POI被打上泛素标签,然后通过泛素—蛋白酶体途径降解。简单来说,这个过程就像是细胞将不用的文件(异常蛋白质)交给秘书(E3酶)盖上作废章(泛素化),然后扔到碎纸机里(蛋白酶体)。

表征三元复合物的特性、构造和稳定性对筛选出最佳的候选药物至关重要。在本应用报告中,我们展示了FIDA技术如何提供三元复合物及各亚基的全面特征,包括所有部分相互结合的Kds、各亚基的大小、三元复合物的形成过程和完整性。

图1: BiTAC驱动的靶向蛋白降解示意图。

材料和方法

Fida 1设备,480nm LED荧光检测结合实验(Fida Biosystems ApS)。FIDA标准毛细管(内径:75µm,LT:100 cm,Leff:84 cm)。工作缓冲液:HEPES缓冲液10mM pH 7.4、200mMNaCl、0.05% Pluronic acid F127、1mM TCEP。使用ThermoFisher Alexa Fluor®488蛋白标记试剂盒标记靶蛋白(POI)作为指示剂(indicator)。这个系统中的POIs称为POI 1和POI 2。

BiDAC分子梯度浓度检测:将POI和E3连接酶浓度分别保持在10nM和40nM,将四种不同的BiDAC分子分别滴定为0-10µM的浓度梯度作为分析物(analytes);流动诱导分散分析:向毛细管中注入analytes+E3(4µL),接着注入39 nL的预孵育POI+analytes+E3,在400mbar的压力下令其向检测器移动。

结果

定量检测三元复合物及其亚基

与TR-FRET、AlphaLISA等其他配体接近结合分析方法(proximity ligand-binding assays)相比,FIDA可直接测量流体动力学半径(Rh)的绝对值,无需校准,也消除了假阳性/阴性的风险。在引入双功能分子BiDAC之前,先测量单独存在时POI的大小,有E3存在时的POI大小,以及未标记的E3大小。单独标记的POI 1和POI 2的流体动力学半径分别为2.85和2.51nm。为了检测有可能存在的正协同效应(positive cooperativity),将E3存在时的POI作为对照,检测得到的大小与单独的POI的大小相同,表明在没有BiDAC的情况下,POI和E3之间没有发生相互作用。

为了验证未标记的E3的大小,在Fida1上进行内在荧光检测,显示E3的Rh为5.8nm。随后,用四种不同的BiDACs P1,P2,P3和P4对POI 1进行测定,四种不同的BiDACs P5、P6、P7和P8对POI 2进行测定。当三个成分都参与结合时,对POI-BiDAC-E3三元复合物,理论上可以预测模拟出一个钟形的结合曲线作为BiDAC浓度的函数(图2),随着BiDAC浓度的增加,三元复合物将向二元复合物转变(2,3)。本实验中Fida 1用于监测标记的靶蛋白(POI)的大小,对BiDACs的浓度梯度检测结果显示出较低浓度时大小(size)增加,随后在较高浓度时大小减少(图3),正如文献中模型所预测的那样(2,3)。

 图2:钟形结合曲线的示例。E3连接酶(蓝色),POI(红色),荧光标签(星形),BiDAC(金色棒状)。

图3:样品条件: POI 10nM, E3 40nM, BiDACs浓度梯度0-10µM. (A) POI1 + E3+ P3; (B) POI1 + E3 +P4; (C) POI2 + E3 +P6. 

图3显示了在POI和E3的浓度保持恒定时,不同BiDAC梯度浓度条件下的复合物大小的数据。所得到的钟形结合曲线与预测模型一致。与其他方法相比,Fida 1测量出的是一个绝对的数值(大小),并且大小的增加与三元复合物的数量成正比,因而Fida 1可以评估出三元复合物中有靶蛋白(POI)结合的比例。

关于FidaBio预测模拟模型

在三元复合物中,涉及到多个结合亲和力,因此标准的二元拟合方程并不适用。在Fidabio,我们开发了一个模型来模拟特定三元复合物结合的趋势,该结合基于POI,POI+BiDAC和E3的大小size。测定各组成部分的扩散系数和Rh后,就可计算出三元复合物(PDE)中靶蛋白(POI)的结合比例。如下图4所示。在这种情况下,表观扩散系数描述如下:

Dif.app=x*DifPDE+y*DifPD+z*DifP

公式中,x为PDE(三元复合物)的分数,y为PD(POI+BAC)的分数,z为P(POI)的分数;DifPDE、DifPD和DifP则分别为PDE、PD和P的扩散系数。协同性alpha在这个模型中也予以了考量,负协同性alpha <1,正协同性alpha >1 (2)。

在Fida 1上测量表观水动力半径(Rapp),在这些条件下按下述公式计算:

Rapp=                           1                              

RPDE-1*x+RPD-1*y+RP-1*z

利用图4所示的拟合模型,可以计算出:协同性,POI和BIAC间的解离常数(Kd[PD]),

BIDAC与E3之间的解离常数(Kd[DE])、三元复合物的大小,以及POI在三元复合物中结合的比例。具体值可见图4例所示。

Fida1为表征BIDACs建立了一种新的标准,可以了解候选药物的全貌。

(请与我们联系以了解更多有关该数学模型的细节。)

图4: FIDA数据与预测模型(A)的比较:POI1+P3BiDAC蓝点,拟合模型橙色点。协同性(alpha):14,6;Kd[PD]34 nM;Kd[DE]44 nm;复合物大小6 nM。三元复合物中POI结合的百分比(B)。

结论

Fida1可以快速和定量地检测三元复合物的整个形成过程,准确测定不同条件下不同亚基间的相互作用,只需微量样品、样品制备简单,软件全面和易用。FidaBio提供了一种新的技术来表征复杂形态的样品;如本文所示的BiTACs,Fida技术可以帮助用户充分了解三元复合物的整个形成过程,以及在PROTAC的开发中其他的重要参数。

此外,测定各组分蛋白的大小也提供了不同亚基的完整性和稳定性的更精确的信息。在PROTACs开发中的另一个步骤,Fida1还能够快速微量和高通量地在体外检测泛素化,而无需繁琐和耗时的SDS-page和Western-blot等电泳转印工作。这方面应用实例请参考后期将推出的泛素化(Ubiquitination)FIDA应用报告。