双特异性抗体为多发性骨髓瘤等疾病提供了新的免疫治疗途径。1它们通常是基于单克隆抗体，单克隆抗体的臂针对不同细胞靶标表面的不同抗原。
体外产生双特异性抗体的目标抗原通常成本很高，时间长，产量低。由于科学家需要从非常小的数量中提取信息，这些抗原的稀缺性使得双特异性抗体的体外优化成为一个困难的过程。
在这里，我们展示了FIDA如何仅用纳升级别的样本来表征双特异性抗体与靶标抗原间三元复合物的形成(图1A)。此外，仅使用纳升级别体积，该技术进行全滴定，产生两种抗原的亲和力，二元络合物大小，三元复合物大小以及协同性(图1B)。协同性是一个极其重要的参数，因为强烈的负值会使任何双特异性抗体不能用于治疗（译者：协同性α是三元复合物形成中的一个重要参数，代表三元复合物形成的稳定程度，α＞1为正协同，表明三元复合物形成较为稳定，若α＜1则相反）。
图A所示。FIDA双特异性抗体鉴定综述。快速表征游离抗原、二元和三元复合物的大小，仅使用120 nL进行三次测量。B.使用样品的µ L对三元配合物形成的所有结合参数进行全面表征，包括所有配合物的大小、KDs和协同性。
配置480nm LED 荧光检测器的Fida 1。FIDA涂层毛细管（L:1m，ID：75μm，Leff：84 cm）。所有实验的缓冲液为PBS+0.1% BSA。Indicator浓度为37 nM。过量的未标记抗原。
为了验证三元复合物的形成，实验以在毛细管中进行：毛细管充满缓冲液，接着注入40nL的样品，利用缓冲液推送。
60个个体双特异性抗体样本在12小时内进行了分析，每个尺寸使用40 nL的样本，不需要用户输入。
为了证实双特异性抗体的整体结构没有抑制形成三元复合物的能力，所有构建都用标记的抗原进行了筛选。
阳性的IgG对照物在与标记的目标抗原结合时引起水动力学半径的改变，用于构建双特异性抗体的Ag1和Ag2特异性片段也观察到了同样的情况(图2)。
总的来说，没有一种体系结构被发现抑制三元复合物的形成，因为尺寸的增加被观察到对二元和三元复合物的形成的所有情况。
值得注意的是，双特异性抗体对同一抗原有多个特异性片段，并不会导致尺寸进一步增大，这表明每个抗原的额外结合位点并不是有益的(图2)。
图2。多种三元配合物的快速确定和上浆。无Ag1的流体动力半径，二元(灰色)或三元复合体(橙色)。无Ag2的流体动力半径，二元(灰色)或三元复合体(橙色)。对于一份三份副本，每个数据点使用的总材料为120 nL。在不需要用户输入的情况下，在12小时内对60个不同的样品进行3次重复筛选。
一个单一的双特异性抗体(BsAb I)被选择为充分的结合特征。图3详细描述了结果。自由标记的Ag2的大小为4.61±0.09 nm, Ag1 KD为7.8 nm, Ag2 KD为0.3 nm二元配合物的尺寸为6.06 nm，与之前测量的值很好地吻合(图2)。三元复合物的大小固定为7.23，如之前测量的(图2)。协作性为1.6表示二进制架构没有任何不利影响，因为它非常接近于1(图3)。
Figure 3. Full characterization of all parameters of ternary complex formation in a single titration. The size of the ternary com- plex was fixed as it was measured in Figure 2.
FIDA能够快速筛查二元和三元复合物的形成，每次只使用40 nL的样品就可以确定双特异性抗体的大小。这提供了一个明显的优势，比传统的方法，如SPR或DLS在信息方面在一个单一的实验中获得的信息和样本，我们的年龄。仅使用双特异性抗体的µL和目标抗原的nL, FIDA就可以进一步充分表征三元配合物的所有结合参数，节省了昂贵的材料。