文献解读 | 利用ATUM转座子平台构建rAAV生产细胞株初探
重组腺相关病毒是目前世界上最重要的基因治疗药物的递送工具，其生产制备依赖于质粒的转染或者病毒对生产细胞的侵染，从而给细胞的放大生产带来巨大的挑战。
本文作者利用合成生物学与Atum转座子技术构建了一种全新的rAAV的HEK293稳定表达细胞株，该表达体系具有较低的基础表达，同时具有较高的诱导表达水平。通过Atum转座平台，实现了包括目的基因，复制元件和包装元件的表达控制，让稳转细胞株就有更好的操控性，也更适合生产放大。
往期介绍链接：
高效细胞株开发| ATUM公司的益拼转座酶平台介绍（中文视频）
基于合成生物学构建重组AAV生产细胞株
重组腺相关病毒是目前世界上最重要的基因治疗药物的递送工具，其生产制备依赖于质粒的转染或者病毒对生产细胞的侵染，从而给细胞的放大生产带来巨大的挑战。本文展示了一种基于合成生物学，无转染和无辅助病毒的rAAV的HEK293表达体系。构建的三质粒系统，包含了rAAV 的Rep，Cap和helper的编码序列和必要的相关启动原件等，共整合进入HEK293细胞内。
1. 基于转座平台的rAAV瞬转细胞株构建流程：
图示：通过Atum的LPN转座系统，载体系统包括三模块，包括rAAV基因组模块，复制模块和包装模块，侵染HEK293后筛选得到单克隆的rAAV的HEK293生产细胞株，经诱导后，可用于生产含目的基因（EGFP）的完整rAAV。
图示：经检测发现，构建出来的HEK293细胞株中的cap和VP蛋白滴度较低，推测其主要原因在复制模块或者cap蛋白的组装。
2. 包装模块的元件优化
图示：通过调整不同的包装模块中的各调控元件，构建不同的包装模块，进行共转染，瞬转表达rAAV，发现PM-F模块的病毒滴度要远高于其他包装模块。
3. 强化CAP蛋白表达的细胞株构建
经上一步瞬转测试的各模块，同时进行稳转的HEK293细胞构建。针对不同的包装模块的稳转表达测定，得到与瞬转类似的结果，PM-F模块较其他模块有明显的优势（GFP为GOI），流程和转染效果见下两个图：
对PM-F模块构建完成的稳转细胞进行了单细胞克隆，得到Pf-3和Pf-6两株单克隆细胞株（以GFP蛋白表达为筛选目标），对比该两株细胞株诱导前后Rep68,cap及GFP的表达变化，并测试其多代次的表达基因稳定性，如下图。
图示：经转录诱导后，Pf-3和Pf-6均展现了较为明显的表达升高，说明构建的载体系统具有较优地表达控制表现。为了确认筛选得到的细胞株的基因整合后的表达水平和整合的长期稳定性，作者利用三重qPCR测试了Pf-3和Pf-6在诱导3和33代（倍增）的目的基因拷贝数，结果说明得到的单克隆细胞株整合和转录表达都较为稳定。
4. rAAV 包装细胞株构建流程
为了展示PM-F对rAAV表达的有效性，作者按下图构建了RM+PM-F+转座酶RNA的转染路线，在完成包装细胞的构建后，再将含有GOI的质粒转染进入包装细胞，流程见下图：
并且，从下图可见，通过单克隆筛选得到的两株细胞RP6和RP7，其诱导和表达特性与之前测试的细胞株类似。
5. rAAV产量与质量的平衡
通过调整诱导水平或者改变不同的病毒组分的比例，可以获得不同水平的产品表达产量和表达量。高诱导水平会导致较高的颗粒滴度，但同时包含目的基因的比率随之降低；反之，较低的诱导水平导致病毒颗粒滴度也较低，但可以获得较高的组装完整性。相较于传统的三质粒转染体系，作者可以实现~35%的完整颗粒，其他文献报道的完整度比例在20%-50%。
诱导前，包括Rep68和DBP处于较低的表达水平，诱导后，各检测指标均达到与内参GAPDH同水平。同时，随着诱导条件增强（从10μg/ml至90μg/ml），VLP123还将有2-3倍的升高，见下图。
根据前文描述的结果，发现诱导后的Pf-3包含5×E04个具备活性的胞内基因组拷贝，换算以后，即每病毒基因组和AAP蛋白应包括1-2个Rep68蛋白。由此，作者推测在病毒组装应存在一个最佳的匹配比例，进而找到一个更为合适的表达量和组装质量之间的平衡。在较低的颗粒滴度水平下，颗粒组装完整程度可达75%，见下图。
对比传统的三质粒包装细胞构建系统，虽然基于转座子系统的基因整合方式的表达水平要低2个数量级（下图），但新方法展现出了更复制元件和包装元件的分别独立控制体系，极富前景。
结论
作者通过借助合成生物学与Atum转座子构建了一种全新的rAAV的HEK293稳定表达细胞株，该表达体系具有较低的基础表达，同时具有较高的诱导表达水平。通过Atum转座平台，实现了包括目的基因，复制元件和包装元件的表达控制，让稳转细胞株就有更好的操控性，也更适合生产放大。尽管目前构建出来的细胞株表达水平仍然比较低，但考虑到本文中并未对rAAV细胞株进行系统性的表达优化，经过一定程度地优化，通常来说，表达量能提高一个数量级以上。另外一方面，本文展示的数据也说明了不同设计的载体架构和相应控制元件，也能对终产品rAAV表达量产生重大影响。
ACS Synth Biol. . 2022 Oct 21;11(10):3285-3295. doi: 10.1021/acssynbio.2c00207. Epub 2022 Oct 11.